脂质纳米颗粒——从脂质体到mRNA疫苗递送

脂质纳米颗粒（LNP）作为COVID-19 mRNA疫苗的重要组成部分，在有效保护mRNA组分及将mRNA转运到细胞发挥着关键作用。除了制药行业，LNP的应用也已扩展到其他领域，如医学成像、化妆品、营养、农业以及纳米反应堆等其他创新领域。

脂质体是LNP的早期版本，是一种极其通用的纳米载体平台，它们可以运输疏水或亲水分子，包括小分子，蛋白质和核酸。事实上，脂质体是最早成功从概念走向临床应用的纳米药物递送平台。许多脂质体药物制剂已被批准并成功应用于医疗实践。

下一代LNP包括固体脂质纳米颗粒（solid lipid nanoparticles, SLN）、纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers, NLC）和阳离子脂质核酸复合物，表现出更复杂的内部结构和增强的物理稳定性。LNP能够控制体内药物递送的位置和时间，可用于治疗各种疾病。越来越多的科学家正在超越传统的生物制药，转向更复杂和更专业的疗法，可以在基因水平上对抗疾病。

脂质体——脂质纳米颗粒的最早一代

脂质体（liposome）是具有封闭的脂质双层的囊泡结构，可以在水中自发形成，最早于20世纪60年代提出（图1-A）。脂质纳米颗粒一词在1990年左右开始使用。由于脂质体在大多数情况下是纳米级的，因此它们理所当然地被认为是脂质纳米颗粒的最早一代。

图1 常见脂质体类型

（A）脂质体
（B）包封疏水和亲水药物的脂质体
（C）用靶向配体功能化的免疫脂质体
（D）用惰性聚合物（如PEG）功能化的空间稳定的脂质体

脂质体作为药物递送系统的潜力随后立即就被认识到。已知超过40%的用于癌症治疗的小分子药物在水中表现出低溶解度，因此能够包封这些药物并提高其水溶性的药物输送系统的好处显而易见。脂质体是最早成功从概念到临床应用的纳米药物递送平台，拥有多项获批的药物制剂。例如，最早批准的脂质体药物是Doxil，是一种抗肿瘤剂阿霉素的脂质纳米颗粒制剂，用于治疗卵巢癌。另一种脂质体药物Epaxal是用作肝炎疫苗的蛋白质原的脂质纳米颗粒制剂。许多其他脂质体制剂已被批准用作药物和疫苗，提供抗癌、抗炎、抗生素、抗真菌、麻醉剂以及其他药物和基因疗法。

脂质体由一个或多个脂质双层组成，大小在20∼1000 nm之间。亲水性药物可以封闭在脂质体的水性内部，而疏水性药物可以包留在脂质双层的烃链区域中（图1-B），使脂质体成为多功能药物递送平台。脂质体按照脂质双分子层数和粒径不同，可以分为直径为20~100nm的小单层囊泡（SUV），直径为100~1000nm的大单层囊泡（LUV），直径为>1000nm的巨型单层囊泡（GUV），以及直径为>500nm的多层囊泡（MLV），其内部为同心洋葱状多层结构（图2）。药物输送系统主要使用SUV和较小的MLV，而GUV主要用作细胞模型。

粒径大小是决定脂质体药物包封和循环半衰期的关键参数，较小的脂质体有更多的机会逃脱吞噬细胞的摄取。普遍认为，用于制药目的的脂质体颗粒，特别是用于肠胃外给药的颗粒，需要≤100nm。纳米颗粒的尺寸可以使用多种技术进行测量，例如动态光散射、尺寸排阻色谱、核磁共振波谱和显微镜。LNP的粒度分布可以通过挤出法、超声法和均质等制造方法进行控制。最近，微流体方法已成功用于LNP制造和尺寸控制。

图2 不同粒径和脂质双分子层数的脂质体

阳离子脂质纳米颗粒与核酸的复合物

随着疾病细胞层面遗传学机制研究的进展，使得针对人类许多疾病基因进行靶向治疗成为可能。核酸疗法包括DNA药物疗法和RNA药物疗法。然而，核酸疗法的发展受到细胞递送困难的阻碍。核酸的负电荷和亲水性阻碍了它们在质膜上的被动扩散。此外，核酸与血清蛋白的结合、吞噬细胞的摄取以及内源性核酸酶的降解会干扰其有效递送。因此，核酸需要递送载体来保护它们免受降解，并将其递送到靶细胞以实现有效摄取。常用的递送载体包括病毒和非病毒载体。阳离子LNP由阳离子脂质和阴离子核酸之间的稳定复合物组成，是核酸药物使用最广泛的非病毒递送系统。

已有大量的阳离子脂质作为核酸载体被合成与测试。阳离子脂质的分子结构与天然脂质相似，差异仅存在于可电离（阳离子）头基而不是天然脂质的两性离子或阴离子头基。阳离子脂质包括具有两个烷基链或胆固醇疏水部分、带正电荷的极性头基团以及连接极性基团与疏水部分的linker。阳离子脂质仅在细胞内带正电荷，而在血液中由于pH值的变化不带电荷，所以它们比非可电离阳离子脂类的毒性小。

与带正电荷的脂质络合可稳定核酸并增强其对核酸酶降解的抵抗力，使其能够递送到所需的靶细胞。核酸通过LNP吸附到细胞表面进入细胞，然后进行内吞作用并将核酸释放到细胞中。由于细胞膜通常带负电荷，而用于核酸递送的纳米颗粒脂质带正电荷，因此静电作用促进了LNP对细胞膜的吸附和与细胞膜的融合，驱动了膜融合和内吞作用。一旦核酸进入细胞，核酸需要从其与阳离子脂质的复合物中释放出来。细胞膜的阴离子脂质可能通过中和阳离子脂质载体的电荷，破坏脂质载体和核酸之间的静电相互作用来帮助从LNP释放核酸。阴离子脂质与阳离子脂质的结合也会破坏纳米颗粒结构，导致非层状结构的形成。阳离子脂质载体在递送核酸方面的功效被认为与其促进非层状脂质相形成的能力相关。短寿命的非层状结构被认为介导膜融合过程；在膜融合中形成的中间体与在层状-非层状相变中形成的中间体相似。

图3 脂质纳米颗粒核酸载体的推荐结构

（A）核酸位于反向脂质胶束组织中
（B）核酸插层在脂质双层之间

固体脂质纳米颗粒（SLN）和纳米结构脂质载体（NLC）

虽然脂质体可用作药物载体，但它们需要使用有机溶剂的复杂生产方法，在捕获药物方面效率低，并且难以大规模执行。固体脂质纳米颗粒（SLN）和纳米结构脂质载体（NLC）旨在解决其中的一些缺点。传统脂质体包含液晶态双层脂质，SLN包含固体脂质，NLC包括固体和液晶脂质的混合物。SLN和NLC的粒径在40到1000 nm之间变化。SLN和NLC表现出增强的物理稳定性，解决了基于脂质体的制剂的主要局限性之一。SLN和NLC还具有更高的装载能力和更高的货物生物利用度，无需使用有机溶剂即可轻松大规模生产，并且与其他LNP相比，灭菌过程中更为稳定。此外，分子在固态下的迁移率降低使SLN和NLC能够更精确地控制其药物有效载荷的释放。然而，在长期储存中，SLN的结晶会将药物成分排出到周围的介质中。通过在室温下将少量脂质液体引入SLN来设计NLC，可降低脂质核的结晶度。NLC结晶度的降低抑制了药物从基质中的排出，增强了纳米颗粒的载药能力和理化长期稳定性。

图4 固体脂质纳米颗粒（左）和纳米结构脂质载体（右）的示意图

SLN和NLC通常采用各种无溶剂方法生产，如高压均质、高速搅拌、超声、乳液/溶剂蒸发、相转化和溶剂注入。

脂质纳米颗粒在药物和疫苗递送中的应用

临床批准的基于LNP的药物

50多年来，脂质体一直被认为是医学的有力工具。它们能够可控地将治疗药物封装和输送到体内的特定位置，用于治疗各种疾病。许多LNP药物制剂已被批准并用于医疗实践。LNP在药物递送中最大的单一应用是癌症治疗，因为LNP包封的抗肿瘤药物比游离药物具有更高的生物利用度和选择性。脂质纳米载体降低了抗癌药物对正常组织的毒性，增加了疏水药物的水溶性，延长了药物停留时间，提高了对药物释放的控制。

图5 批准的LNP药物及其针对的疾病

LNP还通过增强的渗透性和保留性（EPR）效应来提高癌症治疗的疗效。肿瘤中快速但有缺陷的血管生成导致血管具有较大的窗孔（>100 nm大小），LNP可以很容易地通过这些窗孔。因此，肿瘤血管对LNP的渗透性要强得多。当静脉内给药时，它们会在肿瘤中选择性积累。此外，肿瘤中功能失调的淋巴回流降低了LNP离开肿瘤的速度，从而提高了它们的保留。由于EPR效应，LNP在肿瘤中的积累允许纳米颗粒在肿瘤细胞附近选择性地释放抗肿瘤剂。

Doxil是最早批准的抗癌纳米制剂，也是最早批准的脂质体药物。该配方旨在改善蒽环类药物阿霉素的药代动力学和组织分布。阿霉素是一种有效的抗癌剂，但具有心脏毒性。Doxil 的EPR效应，使用空间稳定纳米颗粒延长人血浆中的循环时间，同时降低阿霉素的心脏毒性。它是作为静脉注射剂开发的，用于治疗晚期卵巢癌、多发性骨髓瘤和HIV相关的卡波西肉瘤。

核酸疗法是一类新兴药物，具有治疗各种疾病的潜力。然而，由于核酸是多价阴离子，具有高度亲水性，它们几乎不会被细胞吸收。同时，它们也很容易被血液中的核酸酶降解。因此，它们需要递送载体才能进入细胞并发挥效用。LNP载体是递送核酸药物的成功方法之一。核酸药物Patisiran（ONPATTRO）是一种在LNP中配制的siRNA，用于减少肝脏中转甲状腺素蛋白的形成，最近获得了FDA批准用于治疗遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变。它是最早获批的siRNA药物，也是最早的LNP制剂核酸药物，标志着核酸治疗学发展的重要里程碑。

COVID-19 mRNA疫苗中的LNP

LNP成功使用于辉瑞/BioNTech和Moderna最近批准的两种COVID-19 mRNA疫苗的递送载体。这两种疫苗的开发速度无与伦比，在预防疾病方面显示出显著的有效性。疫苗将编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA递送到宿主细胞的细胞质中；mRNA被翻译成刺突蛋白，该蛋白充当抗原并导致对病毒的免疫反应的发展。

两种mRNA疫苗的脂质纳米颗粒的组成非常相似。两者都含有可电离脂质，在低pH下带正电荷（与RNA络合）和在生理pH下中性（减少潜在的毒性作用并促进有效载荷释放）。它们还含有聚乙二醇化脂质（PEG-脂质），以减少调理作用和吞噬细胞的清除，从而延长体循环时间。二硬酯酰磷脂酰胆碱（DSPC）和胆固醇有助于将货物装入LNP。辉瑞公司疫苗的阳离子脂质∶PEG-脂质∶胆固醇∶DSPC的摩尔比为46.3∶1.6∶42.7∶9.4，莫德纳疫苗的摩尔比为50∶1.5∶38.5∶10。这些纳米颗粒的直径为80~100 nm，每个脂质纳米颗粒含有约100个mRNA分子。

辉瑞专有的阳离子脂质——ALC-0315和Moderna专有的阳离子脂质——SM-102，两种脂质都是叔胺，在低pH值下质子化（因此带正电荷）。它们的烃链通过可生物降解的酯基团连接，可在mRNA递送后实现安全清除。mRNA疫苗中使用的阳离子脂质含有支链烃链，可优化非层状相的形成和mRNA递送效率。PEG-脂质都是PEG-2000偶联物。LNP在低pH（pH4.0）下制备，此时可电离脂质带正电，因此它可以很容易与mRNA形成复合物。微流控装置可将含有mRNA的液流与含有乙醇的脂质混合物液流混合。当快速混合时，这两种液流形成纳米颗粒，捕获带负电荷的mRNA。

图6 COVID-19 mRNA疫苗LNP的脂质成分结构

临床试验中基于LNP的mRNA疫苗和治疗方法

mRNA疫苗和疗法在预防和治疗疾病方面具有很大的前景。LNP启用的mRNA细胞内递送允许在宿主细胞内表达几乎任何所需的蛋白质。基于mRNA的疗法的一个重要特征是插入诱变的风险低。与DNA疗法不同，mRNA不需要细胞核的机制来执行其任务。由于mRNA不整合到宿主基因组中，因此降低了基于mRNA的疗法致癌和诱变的风险，从而提高了其安全性。最后，mRNA的制造比DNA的生产更容易标准化，并且提供了更好的可重复性。
mRNA疫苗因其效率高、开发周期短、成本低、生产潜力高而彻底改变了疫苗开发。如果没有LNP输送核酸技术的进步，就不可能快速开发mRNA疫苗。基于LNP的mRNA疫苗已进入针对多种传染病的临床试验，例如针对寨卡病毒，巨细胞病毒，结核病和流感。mRNA治疗性疫苗在针对黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌和其他实体瘤的癌症免疫治疗方面也具有巨大潜力。LNP载体对于将mRNA成功递送到免疫细胞的细胞质中至关重要，特别是负责触发所需免疫应答的抗原呈递免疫细胞。