竞争ELISA法测定抗体亲和力

抗体亲和力测定的方法很多，竞争ELISA法是一种简便易行的亲和力测定方法，本文主要介绍竞争ELISA法测定抗体亲和力的原理、操作步骤以及注意事项。如果想了解更多抗体亲和力的测定方法，查看抗体亲和力测定方法介绍。

原理

抗原抗体的结合是一个可逆的反应：A+B ⇋AB（A表示抗体，B表示抗原，AB表示抗原抗体结合物）。
当反应达到平衡时，解离常数K_d=[A][B]/[AB]，[AB]表示反应平衡时抗原抗体结合物的浓度，[A]表示反应平衡时游离抗体的浓度，[B]表示反应平衡时游离抗原的浓度。
① 当反应体系中抗体很少，而抗原过量时，反应平衡后[AB]>[A]；
② 当反应体系中抗原量很少，而抗体过量时，反应达到平衡后[AB]<[A]；

③ 当反应体系中抗原抗体的量刚好合适时，反应达到平衡后处于半饱和状态，此时[AB]=[A],则K_d=[A][B]/[AB]=[B]。

在半饱和状态下，如果抗体的浓度很低，反应消耗的抗原很少，则反应后游离的抗原浓度[B]约等于总的抗原浓度[B]_总，此时K_d=[B]≈[B]_总。因此，只要在抗体浓度较低的情况下，找到可以在反应平衡后达到半饱和状态的抗原浓度[B]_总，便可以得到解离常数。
竞争ELISA测抗体亲和力原理

操作步骤

竞争ELISA法测出的K_d值的准确性，依赖于一个大前提：将反应混合物加入包被抗原板后，包被抗原与游离抗体的结合不会破坏抗原抗体反应体系的平衡状态（如果抗原板中抗原浓度过高，结合的游离抗体超过了一定的量，抗原抗体反应体系的平衡会被破坏，此时测得的OD值偏大，最终导致结果偏大）。通常允许抗原板结合的最大游离的抗体量为10%。在进行ELISA法检测抗体亲和力实验时，需要确保抗原不会破坏反应体系的平衡。通常可以用以下操作步骤来确定该包被抗原的浓度是否过高：

包被抗原板，然后用30%的MPBS室温封闭2h，PBS洗涤；
准备梯度稀释的抗体溶液（稀释前的抗体浓度与竞争ELISA实验中的抗体浓度相同），每个稀释液取100mL；加入第一块抗原板中，一式三份（见下图a），孵育1个小时；
使用微量移液器小心移出第一块板中抗体稀释液，将三份相同浓度的稀释液放入一个管中，每个稀释液取100mL加入第二块抗原板中，一式两份（见下图b），孵育1个小时，PBS洗涤；
加入酶标二抗，孵育1个小时，PBS洗涤；
每个孔中加100μl底物，显色30min；
终止显色反应，测定各个孔OD值；
将得到OD值与对应的抗体浓度结合，分别就第一块抗原板与第二块抗原板做两条拟合曲线（见下图c）；

竞争ELISA测抗体亲和力预实验流程

对比两条曲线，如果之间的差值小于10%，则说明该包被抗原的浓度符合要求，如果大于10%，则说明该包被抗原浓度过高，需对包被抗原进行稀释后重新测定。

竞争ELISA测抗体亲和力实验流程

包被抗原板，然后用30%的MPBS室温封闭2h，PBS洗涤。
在一排试管中，利用有限稀释法建立从0.1 nmo/L~1μmol/L浓度梯度的抗原PBS溶液，加入抗体溶液（浓度≤0.5μmol/L）使总体积为100μl。
室温孵育30min后，加90μl反应混合物到前述已包被抗原的微孔中，微孔中预先加人30%的MPBS 30μl后孵育，但时间不宜超过10min（时间不宜过长，过长会导致混合物中反应平衡体系被破坏，最终实验数据不准确）。充分洗涤抗原板。
加入酶标二抗，孵育1h，PBS洗涤。
加入显色底物显色，显色30min后加入终止液停止反应，进行OD值读数。

抗原浓度较低时，反应平衡后[A]较大，被抗原板捕获的游离抗体多，信号强;当抗原浓度高时，反应平衡后[A]较小，被抗原板捕获的游离抗体少，信号弱;当抗原浓度髙到一定程度时，将没有信号。在最强信号一半时的状态为半饱和状态，此时[A]=[AB]，K_d=[B]≈[B]总。将测得的OD值记录，结合梯度稀释的抗原浓度绘制拟合曲线，最终找到最强信号一半的点，对应的抗原浓度即解离常数K_d。