大肠杆菌表达实验标准操作流程（SOP）

实验原理和目的

原理：将外源基因插入质粒或其他载体，再导入活的宿主细胞，使外源基因高效表达，获得所需的蛋白质。大肠杆菌蛋白表达原理及IPTG诱导原理详细内容请访问：原核表达IPTG诱导原理。

实验试剂

• 质粒
• 感受态细胞
• TE：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0
• LB:试管4ml；固体平板
• 抗性：A⁺（100mg/ml）;   K⁺（50mg/ml）;  CI^–
• 保种甘油：C=80%   V=100ml
• IPTG
• 1 x PBS
• 2 x Loading Buffer
• DDH₂O

实验仪器

• 冰箱（4℃）
• 超低温冰箱（-80℃）
• 水浴锅（42℃）
• 摇床（37℃；195r)
• 培养箱（37℃）
• 可见分光光度计（OD600;OD=0.6-0.8）
• 离心机（6000r/min)
• 煮样器（100℃；25min)

详细实验步骤

1. 表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择

• 拿到质粒，离心（3000r/min；2min)
• 在质粒中加入TE【使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加入TE的量】，一般为（1μg质粒加20μLTE；2μg质粒加50μLTE；5μg质粒加100μL TE）
• 将质粒与TE混匀，吸取2μL混液与感受态细胞混匀
• 将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min
• 取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,
• 再次放入冰箱（4℃）中，3min
• 拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
• 放入摇床（37℃;  195r) 中,  30nim至60min; （最佳45min）
• 取出离心（3000r/min；2min)
• 去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂平板，【先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min】
• 把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h至16h）

2.  表达鉴定第二天的任务，注意Pcold表达载体的表达温度

• 每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的LB（4ml）试管中，编号为“0”“1”“2”“3”
• 将试管放入摇床（37℃；195r) 中，【单抗性3h左右；双抗性4左右；刚开始用可见分光光度计测OD值；熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）】，测OD值（0.6至0.8）
• 从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存
• 在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG【终浓度0.5mM最适，可根据日后表达摸索】
• 视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h至4h（4支试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h至4h）。Pcold：【全部15℃表达过夜】

3. 表达鉴定第三天，全菌的表达鉴定分析，注意控制溶质的量及溶液黏度

• 从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中，【若OD值不一样，值小的可多取】离心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀【沉淀少的，可再取菌液离心，尽量使沉淀量接近】
• 在每个离心管中加入500μL的DDH₂O,悬浮沉淀，离心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀
• 在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀【当溶质适量且均一的情况下，加入量不变；当溶质多且粘稠时，应使加入量增大，为降低粘度也可减少上液量】
• 放入煮样器（100℃） 25min
• 取出后离心（6000r/min)  3min,  电泳检测。
• 蛋白表达量不错，进行蛋白纯化；蛋白表达量低或者没表达，可参考原核表达FAQ相对应解决方案解决。

4. 蛋白纯化：见蛋白纯化专题

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