不同反应的“强”“弱”的标准:
动力学是通过实时的结合解离曲线计算得到解离常数和结合常数来更细致的描述相互作用。一般只能通过实时监测的技术获得, 比如 BLI。亲和力是描述反应强弱, 基于终点技术的很多方法可以获得, 比如 ELISA。动力学包含了亲和力, 但是亲和力不包含动力学。
如果需要获得 KD 值,必须要知道分析物的浓度。KD 值越大,需要的分析物的测试浓度越大。
小到150 Da的化合物,大到病毒,以及多肽,蛋白质,DNA/RNA,多糖,多聚物,脂质体,纳米颗粒等均在
BLI的可测试范围。
如果是 SA,SAX,SSA,AR2G,APS 传感器,固化蛋白一定要纯化。如果是基于capture类传感器,固化蛋白不一定需要纯化。但是固化纯化的物质可以减轻杂质带来的影响。
信号和结合上去的分子的大小和密度有关。对不同物质来说,分子越大,信号越高。对同一种物质来说,结合越多,信号越高,结合量和信号呈正比。
小到150 Da的化合物,大到病毒,以及多肽,蛋白质,DNA/RNA,多糖,多聚物,脂质体,纳米颗粒等均在BLI的可测试范围。
生物素试剂与蛋白的摩尔比在 1:1 – 3:1 之间。目前使用最多的是氨基偶联的生物素化试剂,所以待生物素化的物质溶液中除了需要生物素化的物质外,不得含有其他带有氨基的保护剂以及缓冲液 (特别是 Tris 缓冲液)。生物素化完成后需要脱盐除去未反应的生物素化试剂。
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