PCR模板的制备

PCR模板制备是PCR实验的首要步骤，模板制备是从待分析样本中纯化和浓缩核酸（DNA或RNA）以作为PCR扩增模板的过程。由于PCR用途多样，用于提取核酸的材料可能是全血、动植物组织、培养细胞、口腔涂片、体液、甚至是1700万年前到2000万年前的木兰叶化石。对于不同类型的样本，需要利用不同的方法进行核酸提取。下面分别就PCR模板制备的步骤及不同材料的模板制备方法做一介绍

模板制备步骤

PCR模板制备指的是从样本中提取核酸的过程，涉及到裂解细胞、蛋白变性、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤，下面分别就这些步骤做一介绍。

裂解细胞

裂解细胞的方法有以下几种：

物理破壁法：超声波处理、研磨法、玻璃珠法等，适用于带细胞壁细胞的裂解，破碎时需液氮冷冻处理增加细胞壁脆性，细胞破碎后需快速加入TE缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。
（TE缓冲液成分：10mM Tris-HCL，1mM EDTA PH8.0，Tris-HCL的作用为提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏、EDTA的作用为螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；）
化学试剂：SDS、TRIzol（主要用于提取RNA）等。SDS可以促使细胞壁破裂，同时破坏细胞膜结构；TRIzol主要成分是苯酚和异硫氰酸胍，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
酶解法：溶酶菌、蛋白酶K、蜗牛酶等。蛋白酶K适用所有标本的消化处理，蜗牛酶常用于酶解真菌，溶酶菌可以对细菌进行裂解。
煮沸法：通过煮沸进行细胞的裂解，适用于质粒DNA的提取。
微波法：通过微波加热使细胞裂解，可以用于真菌基因组DNA的提取。

蛋白变性

蛋白变性的目的为使核酸与蛋白质之间的结合键断裂，便于后续去除蛋白质。可以利用SDS等去污剂使蛋白变性，也可利用煮沸的方法使蛋白变性。另外，在苯酚-氯仿抽提的步骤中，苯酚也可以使蛋白变性。

苯酚-氯仿抽提

质粒抽提

苯酚-氯仿抽提的目的为去除细胞裂解液中蛋白、多糖、酚类等杂质，分离核酸。使用苯酚-氯仿溶液处理裂解后的匀浆液，最终核酸分子溶于上层的水相，多糖、酚类等处于下层的有机相，蛋白质则沉淀于两相之间。

在苯酚-氯仿溶液中苯酚的作用是使蛋白变性，同时抑制DNase的降解作用；氯仿是分子量比较大的有机溶剂，使用氯仿作为有机相可以达到快速的和无机相分离的效果。在用苯酚-氯仿抽提核酸时，通常要加入少许异戊醇（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间变性蛋白相及下层有机相溶剂维持稳定。

乙醇沉淀

核酸具有不溶于无水乙醇（准确的说是浓度为66%以上的乙醇）的特性。苯酚-氯仿抽提后取上层水相，加入无水乙醇，轻轻混匀后即出现丝状的沉淀。离心，弃去上清，沉淀即为核酸。最后利用TE缓冲液重新溶解核酸，即可作为PCR的模板。

说明：由于PCR实验对于模板纯度要求并不高，因此不需去除杂质，同样可以PCR的模板。例如对于单细胞的微生物、血细胞或培养的细胞，利用SDS破坏细胞膜结构使DNA释放出来，即可直接作为模板。对于较复杂的动植物组织则添加蛋白酶K进行适当消化，即可达到同样的目的。

常见的DNA模板制备方法

常见的DNA模板制备方法有CTAB法、SDS法、蜗牛酶法、蛋白酶K消化裂解法、碱裂解法、煮沸法、微波法等。不同的方法适合处理的样本种类也有所不同，下面分别就这些方法做一介绍：

CTAB法

CTAB法通常用于植物DNA的提取。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCL）是可溶的，当降低溶液的浓度到一定程度（0.3mol/L NaCL）时从溶液中沉淀。
研磨破碎细胞后加入65℃预热的CTAB，通过离心就可以将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，加入乙醇使核酸沉淀（CTAB能溶解于乙醇中，不会沉淀），最终收集得到核酸。

蜗牛酶法

蜗牛酶法常用于真菌基因组DNA的提取。其原理为利用蜗牛酶裂解细胞，随后经蛋白变性、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤即可得到基因组DNA。

微波法

微波法可以用于真菌基因组DNA的提取。其原理为利用微波加热破碎真菌，并使蛋白变性，随后经苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤即可得到基因组DNA。

蛋白酶K消化裂解法

蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理。蛋白酶K消化液的配方为：

10mM/L Tris-HCL（PH8.0），10mM/L EDTA，150mM/L NaCL，0.5%SDS，100~200ug/ml蛋白酶K（蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中）

在样本中加入蛋白酶K消化液，待细胞裂解后，经苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤即可得到模板DNA。

碱裂解法

碱裂解法通常用于从细胞中提取质粒DNA质粒。其原理为将细胞置于强碱性（NaOH）环境，强碱环境使细胞裂解，同时使细胞裂解释放出来的DNA变性，随后用酸性溶液中和使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA由于分子巨大难以复性。离心后，质粒DNA在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细胞中提取出来。

煮沸法

煮沸法通常用于从细胞中提取质粒DNA。其原理是将细胞悬浮在含有能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使细胞裂解，同时使DNA解链、使蛋白质变性。闭环质粒变性后DNA链彼此不会分离，当温度下降后又会重新形成超螺旋分子。染色体DNA不会复性，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可以从上清中回收质粒DNA。