骆驼科动物IgG1 VH区序列分析

重链和轻链异四聚体的IgG抗体形式曾是抗体结构的不二法则。直到Hamers-Casterman等人1993年在骆驼科物种单峰驼（Camelus dromedarius）中发现了一种新的抗体结构——重链抗体（HCAbs）。重链抗体的可变区结构域（VHH），又称纳米抗体，这种新型抗体的独特结构和新颖特性使其在各领域均有广泛的应用价值。

对骆驼科所有物种的免疫学调查研究显示，骆驼科动物体内均含有常规抗体（Conventional IgG）和HCAbs两种结构的抗体。常规抗体（IgG1）包含两条轻链（由VL和CL结构域组成）和两条重链（由VH、CH1、铰链、CH2和CH3结构域组成），两种重链抗体（IgG2和IgG3）为仅包含重链的同二聚体，每个重链包含VHH、铰链、CH2和CH3结构域。IgG2型的铰链长度较IgG3型长。

图1 骆驼血清中天然存在的抗体示意图

多项研究对骆驼科动物IgG1抗体VH序列的相似性、多样性以及CDR区长度分布等几个方面进行分析，证实骆驼科动物IgG1的VH序列与人抗具有高度一致性，且VH(4)家族CDR3区长度分布与VHH CDR3区类似，长于小鼠IgG。

VH序列相似性分析

骆驼科动物和人类VH序列具有高度的一致性。有研究发现，骆驼VH(3)共有序列与美洲驼框架区残基序列一致性可达100%，与人类框架区序列之间的一致性可达94%，只有残基49，74，83和84的4个保守差异。骆驼VH(4)共有序列与人类共有框架序列的同源性稍低，为86%。各种哺乳动物免疫球蛋白序列的框架一致区域的系统发育分析显示，单峰驼、美洲驼、双峰驼VH(3)序列聚类最接近人类VH(3)；而单峰驼和双峰驼VH(4)序列与人类VH(4)、绵羊VH(2)和小鼠VH(2)均在同一聚类。

图2 骆驼科动物重链可变区框架序列与其他哺乳动物物种的相应区域间的系统发育树

VH序列多样性分析

可变区基因的体细胞高频突变增加了抗体多样性，特别是在CDR环中，在框架区中也是如此。有研究基于57个骆驼科IgG1抗体序列总结了其框架区的变异性（图3），结果表明：（1）在框架1和3中观察到的变异性高于框架2；（2）VH(3)框架的变异性始终高于VH(4)框架：这可能反映了VH种系基因使用的差异，以及随着免疫反应的成熟对VH(3)的偏好高于VH(4)；（3）与IgG1a亚型相比，IgG1b亚型中框架区域的更大变异性，可能是由于免疫应答成熟过程中的同型转换。

图3 VH、VK和VL框架区序列变异性

在另一项研究中，研究者使用Mi-Seq系统对三头双峰驼体内抗体进行测序，测序结果表明：（1）框架区比CDR区相比更为保守，这与先前的认知一致；（2）框架2区不如其他框架区保守；（3）CDR2区的多样性高于所有其他区域；（4）VH和VHH的CDR3多样性是相似的。

图4A FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3和FR4的子区域的唯一序列数量
图4B 归一化后的多样性评价，等于唯一序列数量除以每个子区域的平均序列长度

CDR区的长度分布

基于Kabat定义比较了骆驼科动物VH(3)和VH(4)序列之间的差异，图5ab详细描述了CDR-H1和CDR-H2长度的变异性。在34条VH(3)序列中，CDR-H1均为5个残基；在所有23条VH(4)序列中，CDR-H1除1条例外为6个残基，其他均为7个残基。VH(4) CDR-H2只出现包含16个残基一种可能性，而VH(3) CDR-H2的范围为16~22个残基，众数为17个残基。

图5 骆驼科动物VH(3)和VH(4)序列CDR-H1、CDR-H2长度分布

CDR-H3观察到的长度变化最大。VH(3)序列通常显示较短的CDR-H3长度，残基数量范围3~18，其中最常见的情况是12~13个残基。相反，VH(4)序列的CDR-H3长度分布更集中，从11到20个氨基酸，最高频率的为14和17个氨基酸。

许多研究报道，骆驼科动物VHH结构的一个关键特征是较长的CDR-H3区。结构研究表明，VHH结构可以利用其较长的CDR-H3环更好的与目标蛋白表面缝隙（clefts）结合。将其与骆驼科动物的VH的CDR-H3长度进行比较发现，32条VHH CDR-H3序列中只有7条（22%）长度大于VH(4)的20个残基，所有VH(4) CDR-H3序列长度都在VHH抗体的CDR-H3长度范围内（7~24个残基）；与公共数据库（http://www.bioinf.org.uk/abs）中提取的人类和小鼠VH CDR-H3长度进行比较，可以发现骆驼VH(3) CDR-H3长度分布与小鼠IgG相似，而VH(4) CDR-H3长度较小鼠IgG更长。由此我们可以进行推断，与VH(3)相比，VH(4)对较长CDR-H3长度的偏好是否也能使相应抗体更好的与蛋白表面结合。

图6 骆驼科动物VH(3)和VH(4)序列CDR-H3长度分布

参考文献
[1]Griffin LM, Snowden JR, Lawson AD, et al. Analysis of heavy and light chain sequences of conventional camelid antibodies from Camelus dromedarius and Camelus bactrianus species. J Immunol Methods. 2014 Mar;405:35-46.
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[3]Henry KA, van Faassen H, Harcus D, et al. Llama peripheral B-cell populations producing conventional and heavy chain-only IgG subtypes are phenotypically indistinguishable but immunogenetically distinct. Immunogenetics. 2019 Apr;71(4):307-320.

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