酶解法与表达系统制备Fab流程简述

酶解法制备Fab

利用木瓜蛋白酶生产Fab片段

取实验室自制的抗体或IgG粉末置于0.01mol/L的PBS（ph=7.4）中透析3h，调整抗体浓度1mg/mg。
将木瓜蛋白酶干粉溶于活化溶液（0.1mol/L PBS，ph=7.4，其中加入0.2mol/L EDTA和0.01mol/L半胱氨酸），配置成1mg/mL的溶液。37℃活化20min。
将木瓜蛋白酶与抗体溶液按1:10的比例混合，在37℃下反应6h。
将反应完产物使用10kDa的超滤管在4000rmp，4℃下超滤，除去木瓜蛋白酶，同时替换溶剂为0.01mol/L的PBS（pH=7.4），溶解后的溶液即为Fab片段与Fc片段的混合物。
对酶解产物进行纯化。

利用胃蛋白酶生产F（ab’）₂并进一步生产Fab’片段

以嵌合抗CD 20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达为例^[1](下文中提到的载体与表达菌株均由该实验室自行构建)
表达载体构建

利用PCR法从抗CD₂₀ScFv表达载体上扩增V_H、V_L基因，经琼脂糖电泳分离纯化后，分别以限制性内切酶MluI+ApaI、MluI+StyI消化，然后重组到带有人免疫球蛋白相应CH₁、C_L的pYZH1、pYZL载体相应的内切酶位点中，得到重组子pYZH1cd20、pYZH1cd20。
用所得的重组子转化大肠杆菌菌株，扩增培养后提取pYZLcd20、pYZH1cd20质粒，分别以限制性内切酶MluI+NheI，SpeI+SphI消化pYZLcd20、pYZH1cd20。
琼脂糖电泳分离纯化含V_L、V_H的相应DNA片断，利用NheI、SpeI同裂酶的特点，将这两个片断和经MluI+SphI消化所得的pYZF载体片断连接成抗CD₂₀Fab表达载体pYZF1cd20。

可溶性表达及分离纯化

将载体pYZF1cd20转入大肠杆菌菌株，经筛选与扩大培养后，挑取阳性克隆单菌落接种5 ml含氨苄青霉素50 μg/ml的2×YT培养基（蛋白胨6%，酵母膏1%，氯化钠0.5%，pH7.4），37℃，200 r/min，振荡培养6 h，至OD₆₀₀＝0.6；6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌株。
将菌株重新悬浮于20 ml含氨苄青霉素50 μg/ml的AP₅培养基（每1 000 ml含酸水解酪蛋白11 g，酵母膏0.6 g，硫酸镁0.19 g，葡萄糖1.5 g，氯化铵1.07 g，氯化钾3.73 g，氯化钠1.2 g，1 mol/L三乙醇胺(pH7.4)120 ml，过滤灭菌），30℃，250 r/min，振荡培养20 h；6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌体。
将菌体于-20℃冻存1 h，化冻后加1 ml细菌周质腔蛋白提取液，混匀，置于4℃轻摇1 h，12 000 r/min，4℃离心20 min，取上清。
用Protein G Agrose亲和柱分离纯化Fab。