抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
而单克隆抗体（monoclonal antibody）则是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤（hybridoma）技术来制备——杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的B细胞和具有无限生长能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即单抗。
与多抗相比，单克隆抗体具有纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应等优点。单克隆抗体技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。（单抗与多抗的区别）
抗体是具有4条多肽链的对称结构，形状类似于“Y”的结构，分子量约150kDa。Ig分子的结构包括两个二硫键连接的两半相同的糖蛋白，由两条相同的50kDa的重链（Height Chain）和25kDa的轻链（Light Chain）组成，通过在轻链羧基末端附近的二硫键连接在一起。轻链有κ和λ两种，重链有α、δ、γ、ε和μ五种。
IgDPart of the B cell receptor。Activates basophils and mast cells。
| Name | Properties |
| IgA | Found in mucous，saliva，tears，and breast milk。Protects against pathogens。 |
| IgE | Protects against parasitic worms。Responsible for allergic reactions。 |
| IgG | Secreted by palsma cells in ther blood。Able to cross the placenta into the fetus。 |
| IgM | May be attached to the surface of a B cell or secreted into the blood。Responsible for early stages of immunity |
一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段（antigen-binding fragment, Fab）。”Y”的柄部称结晶片段（crystalline fragment, FC），糖结合在FC 上。整个抗体分子可分为恒定区（C区）和可变区（V区）两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区（hypervariable region，HVR）。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2～3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。碳水化合物连接到抗体分子的Fc端，Fc区含有所有的免疫球蛋白共有的蛋白质序列及各个类别独有的决定簇，且在相同类别的不同Ig分子上没有显著变化，所以Fc端称为恒定区。
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mAb的生物学功能主要是由其结构决定。抗体由抗原结合域（Fab）和结晶区域（Fc）组成，Fab主要特异性识别肿瘤相关抗原，进而调控下游的信号通路。Fc可以识别并结合表达Fc受体的免疫细胞以及血液中的补体进而介导抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）, 抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）以及补体依赖的细胞毒作用（CDC）等效应功能，Fc还可以结合新生IgG转运受体（FcRn）从而在体内不被轻易清除而延长了其在机体内的半衰期。在这里根据抗体的结构，我们将其作用机制分为Fab相关的作用机制和Fc相关作用机制。
1）识别游离的靶点
游离于血液循环中的细胞因子、促血管生成因子、生物毒素等都可以作为单抗的作用的靶点。蛋白因子通过与受体的结合，传导信号进入细胞，调控细胞的功能。过量表达的蛋白因子传导过量的信号，打破细胞的正常功能。毒素和病毒等也必须通过与细胞表面的受体结合进入细胞内部从而发挥作用。中和抗体的作用机制就是通过结合抗原进行中和，使抗原丧失结合受体的能力，进而丧失生物学功能。常见的针对游离靶点的抗体有血管内皮生长因子（VEGF）抗体，肿瘤坏死因子（TNF）抗体，炭疽毒素中和抗体等。
识别细胞表面受体的单克隆抗体的作用机制(Fab dependent)
每一种抗体都可以特异性结合特定的抗原靶点。靶点抗原表达在细胞表面，具有特定的功能，例如细胞激活、生长或迁移等。根据Fab活性，可以分为结合、拮抗和激活三种类型。结合型抗体只是结合在靶蛋白表面但并不影响其功能。因此，靶蛋白受体的配体仍然可以与其结合，从而传递信号。结合性抗体可以用于标记靶细胞，从而让其Fc产生效应功能或通过搭载毒素来杀灭靶细胞。拮抗性抗体封阻受体上的与配体相互作用所需的表位，阻止配体结合产生的信号传导。激活型抗体能够模拟配体的功能，识别结合靶受体并传导信号至细胞内部。基于被激活的细胞内信号强弱，激活型抗体可能在治疗时使得靶细胞被激活并释放细胞因子，进而产生副作用。
单克隆抗体通过其Fc部位结合各种FcγRs，进而发挥其效应功能，包括ADCC, ADCP和CDC。以最常见的IgG1为例，其Fc区域通过结合FcγRIII（CD16A）激活NK细胞诱导ADCC；与巨噬细胞上FcγRIII（CD16A），FcγRII（CD32A）和FcγRI（CD64）结合，引发ADCP；与补体的C1q结合激活补体引发CDC。Fc还能够以pH依赖的方式结合FcRn，避免被核内体降解，从而延长单克隆抗体的半衰期。
单克隆抗体（IgG1）作用机制(Fc dependent)
1）抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）
ADCC作用是一种细胞介导的免疫防御机制，在靶细胞膜表面抗原结合了特异性的抗体的情况下，激活免疫系统的效应细胞进而裂解靶细胞的作用。因其对已存在的抗体的依赖性，ADCC作用是适应性免疫反应的一部分，也是体液免疫反应的一部分，用于限制和消除感染。经典的ADCC作用通常由NK细胞介导，但巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也能介导ADCC作用。比如嗜酸性粒细胞能通过ADCC作用杀死某些特定的寄生虫。
体外检测ADCC效应有几种方法，一种是标记靶细胞的方法：比如用51Cr或具有膜通透性的甲基酯荧光染料，比如calcein-AM或DELFIA-BATDA。靶细胞标记后，加入抗体孵育，然后再加入NK92/CD16A细胞或者从PBMC纯化的NK92，或者PBMC作为效应细胞，不同的效应细胞和靶细胞的比例，不同的孵育时间(通常低于4小时，更长的孵育时间也是可以的，只是自发释放会相应变大)。孵育结束后，加入enhancing solution，用不同的仪器检测放射性同位素和荧光染料，这些方法相对可信但灵敏度不够。其他一些方法，例如检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放，这个方法的缺点是由于靶细胞没有被标记，不能区分效应细胞和靶细胞的释放，所以也没有被频繁使用。最有吸引力的检测ADCC效应的方法是基于流式细胞术法（FACS）检测，这种方法通常需要标记靶细胞，或者同时标记靶细胞和效应细胞，然后检测靶细胞的活细胞的减少量，然而这种方法相对比较复杂，因为FACS检测时出现至少两群细胞（包括靶细胞和效应细胞），这需要染双色或者三色。相比较其他，用FACS方法检测ADCC相对可靠，最终结果需要一个独立的方法来验证。无论使用哪种方法，效应细胞通常是PBMC或纯化的NK细胞。效应细胞需要用IL-2预活化过夜以增强效应细胞的活性，但由于个体的差异，以及FcRγIIIA多态性的原因，导致同一个抗体的每次ADCC实验数据差距很大，可重复性差，而使用NK细胞系稳转CD16A，使体外ADCC实验变得更稳定，可重复性强。
2）抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）
众多小鼠体内实验表明，IgG1的治疗性抗体作用与巨噬细胞及其表达的FcγRs尤其是FcγRIV高度依赖，这些细胞不会引发高效的ADCC效应但是会引发ADCP效应，所以了解ADCP的作用机制也是很有必要的。
测定抗体的ADCP与ADCC类似，都取决于共孵育的两种细胞：适应的靶细胞加入到效应细胞中（巨噬细胞或中性粒细胞），共孵育1-2小时，有时候也需要更长的孵育时间。效应细胞通常是从外周血单核细胞（PBMC）通过免疫亲和方法富集或纯化而来。然后在血清或生长因子例如GM-CSF和/或M-CSF存在下，将它们体外分化4-7天。因此，效应细胞可以广泛变化，不仅是由于供体关联的FcγRs多态性，而且还由于单核细胞来源，纯化程序，分化成巨噬细胞的时间和条件等。
3）补体依赖的细胞毒作用（CDC）
补体是存在于血清与组织液中一组不耐热的，经活化后具有酶活性的蛋白质。抗体的Fc片段能够结合血清补体分子（C1q），继而形成膜攻击复合物（MAC）清除目的细胞。补体的激活过程是个级联过程。首先是识别阶段：抗原与抗体结合后，C1q能识别抗体上的补体结合点，并与之结合。由于C1q的构型发生改变，可激活C1r和C1s；在Ca2存在下，形成具有酶活性的C1s。接着是活化阶段C1s将C4分解成小碎片的C4a和大碎片的C4b，C4b可与细胞膜结合；C1s激活C4后，再激活C2（分解成C2a和C2b）；
C2b与C4b结合，形成有酶活性的C4b2b（C3转化酶）。C3被C4b2b裂解在C3a和C3b两个片段，C3b与C4b2b相结合产生的C4b2b3b为经典途径的C5转化酶。最后为攻膜阶段C5在C4b2a3b的作用下裂解为C5a和C5b，C5b与细胞膜和C6、C7结合，形成C5b67复合物，进而与C8、C9分子联结成C5b6789复合体，即为攻膜复合体，造成细胞膜溶解。
虽然许多治疗性抗体恒定区都是人的IgG1的Fc，但它们激活补体的能力却有极大的不同。激活补体不仅需要靶细胞表面表达较高密度的抗原，也需要抗体分子的高特异靶向性，高靶向性才能结合多个C1q并且有效激活补体。另外，位于细胞表面或者一些游离的补体抑制剂能够有效阻断补体级联反应。肿瘤细胞在其细胞表面经常高表达一些补体抑制剂如CD46，CD55和CD59，这些分子能够保护靶细胞免受补体介导的杀伤作用。因此，基于以上这些多因素的存在，导致许多IgG1的抗体只具有非常弱的CD作用。
杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术：将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，可以得到既能产生抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，利用杂交瘤细胞可以大量的生产单克隆抗体。
杂交瘤技术是在体细胞融合的技术基础上发展而来的，1975年，Kohler和Milstein成功把免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，形成了B淋巴细胞-骨髓瘤细胞杂合体，这种杂合体既能在体外培养中无限地快速增殖且存活，又能分泌单克隆抗体。随后，他们在英国《自然》杂志上发布了这一成果，并正式提出了杂交瘤的概念。
单克隆抗体由单一B淋巴细胞分泌得到，但B淋巴细胞在体外不能长期存活（最多两周），因此无法制备单一B淋巴细胞群，也无法进行单抗的大量生产。骨髓瘤细胞不具备分泌抗体的能力，但是可以在体外培养条件下无限繁殖。将免疫B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，得到的杂交细胞具有双亲细胞的遗传特性，既能像B淋巴细胞一样分泌抗体，又能像骨髓瘤细胞一样无限增殖，成功克服了B淋巴细胞在体外存活周期短的问题。对杂交瘤细胞进行培养，即可得到单克隆抗体。
细胞融合技术是杂交瘤技术的基础，通过聚乙二醇（PEG）（最常用）、仙台病毒、电转等方法对细胞进行人工诱导，可使两个细胞通过膜融合形成单个细胞。
HAT培养基筛选技术是杂交瘤技术中另一个关键的技术，在B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，会产生多种融合结果（未融合的骨髓瘤细胞、未融合的B淋巴细胞、B淋巴细胞自身融合细胞、骨髓瘤细胞自身融合细胞、正确融合的杂交瘤细胞），为了得到所需的杂交瘤细胞，必须利用HAT培养基对融合后的细胞进行筛选。HAT培养基的筛选原理为：DNA合成途径有生物合成途径与应急合成途径两种，HAT培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质，氨基喋呤可以对DNA的生物合成途径进行阻断，骨髓瘤细胞会因为生物合成途径被阻断且自身缺乏应急合成途径导致不能增殖进而快速的死亡；而B淋巴细胞因缺乏体外增殖的能力，一般在10天左右死亡；杂交瘤细胞具有体外增殖能力且由于次黄嘌呤与胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通过应急途径合成DNA并在HAT培养基中正常生长，不会死亡。因此将融合后的细胞放于HAT培养基中培养，其他的融合结果会全部死亡，最终筛选出杂交瘤细胞。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为：抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。（详细实验流程：杂交瘤单克隆抗体制备SOP）
图1：杂交瘤制备单克隆抗体流程
优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。
缺点：a.操作步骤繁琐。b.利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体( HAMA）反应、在人体循环系统中很快被清除等。
人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。
第一代人源化抗体是将鼠McAb的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体。由于异源性Ab的免疫反应约有90%是针对恒定区（C区），要降低mAb的抗原性，必须对Ab的恒定区进行人源化。构建嵌合抗体的大致原理是，从分泌某mAb的杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出重排的功能性可变区（V区）基因，经基因重组与Ig恒定区基因相拼接，插入到适宜的表达载体中，构成鼠/人嵌合的轻重链基因表达质粒，经转染骨髓瘤细胞，通过筛选即可制备出鼠/人嵌合抗体。这种嵌合抗体同鼠源抗体比较至少有以下两个优点：CDR移植技术的理论依据是：
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抗体库技术包括噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术。
噬菌体抗体库技术：是利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与噬菌体的外壳蛋白Ⅲ（PⅢ）或外壳蛋白Ⅷ（PⅧ）基因随机重组，继而感染大肠杆菌，后经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或单链抗体可变区（ScFv）一外壳蛋白的融合蛋白形式表达。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程，就能筛选并富集特异性抗体。所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。其最大特点是实现了直接将基因型和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体。
如去掉3′末端终止密码子，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA 的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA 进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。
VelocImmuneTM：不同于以往的转基因小鼠抗体筛选平台，VelocImmuneTM产生人可变区与鼠恒定区组成的反向嵌合抗体。小鼠Ig H恒定区通过B细胞胞质区的信号转导区域(如Igα与Igβ)传递天然的免疫信号，并通过与其他类型免疫细胞上的Fc受体的结合促使小鼠产生强大的免疫反应，并提供半衰期长且亲和力高的抗体。该类转基因小鼠免疫后产生的抗体可变区编码序列通过基因克隆技术与人源恒定区编码序列进行构建，反向嵌合抗体即可转变为适宜药用的全人源抗体。配对抗体指的是可以同时结合在一个抗原分子上的两个抗体。配对抗体，一般应用于双抗夹心法ELISA实验。
通常情况下，一个抗原分子拥有多个抗原决定簇，将抗原注射入动物体内进行免疫，针对不同的抗原决定簇会产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性与专一性，即一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原决定簇。两个针对不同抗原决定簇的抗体，有可能同时结合到抗原分子上。如果两个抗体同时结合到同一个抗原分子上，那么这两个抗体就是配对抗体。
需要注意的是，即使两个抗体针对的是不同的抗原决定簇，也并不意味着这两个抗体分子一定可以同时与抗原分子结合。当一个抗体与抗原结合后，有可能会导致其他结合位点（抗原决定簇）构型的改变，从而导致其他的抗体无法正常结合到抗原上。位阻效应的存在，也可能使两个结合位点距离较近的抗体无法同时结合在抗原上。因此想要得到可以同时结合在抗原分子上的配对抗体，在制备出抗体后，还需要对得到的抗体进行筛选。这就意味着，要制备配对抗体，要完成以下两步工作：抗体的制备；配对抗体的筛选。
为了便于后续的筛选，制备的抗体应为单克隆抗体，通常利用杂交瘤技术进行单克隆抗体的制备（详细操作流程请见：杂交瘤制备单克隆抗体实验流程）。
注意：如果单克隆抗体很少，很可能会找不到可以配对的抗体，因此，在免疫动物的时候，应多免疫几只动物，以获得更多的单克隆抗体（德泰生物为您提供>10只以上小鼠的免疫，筛选配对抗体）。
通常，配对抗体筛选的方法是双抗夹心ELISA法。筛选的原理为：在得到了单克隆抗体后，从中取出两种单克隆抗体，一种作为捕获抗体，另一种作为标记抗体（HRP酶标记），将捕获抗体包被在抗原板上，先加入抗原，孵育后洗去未结合的抗原，再加入标记抗体 孵育后洗去未结合的标记抗体，最后加入显色液显色。如果可以显色，说明标记抗体与抗原特异性结合，该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色，说明标记抗体不能与抗原结合，从而被洗脱，该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体。如果选择的两种单克隆抗体不能进行配对，则需重新选择两种单抗，重新进行试验，直至找出可以配对的抗体。
图1：双抗夹心法ELISA筛选配对抗体原理利用双抗夹心法对目的抗原进行定性定量的检测，必须要用到可以同时与目的抗原结合的配对抗体。对于比较常见的目的抗原，可以通过购买试剂盒的方式得到相应配对抗体。但是市面上试剂盒的种类有限，有些目的蛋白在市面上无法买到对应的试剂盒，为了进行双抗夹心法ELISA实验，需进行相应的配对抗体的生产。
抗体配对服务：准备的配对用的抗体≥10株，双抗夹心ELISA实验，OD值≥阳性对照。
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆,在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的方法很多，有有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。这里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法:
96孔细胞培养板、HT培养基、活力强的杂交瘤细胞、小鼠腹腔细胞
说明：本法中（b）（c）（d）等步骤也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确的进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。
HT培养基（双倍浓度）、小鼠腹腔细胞、灭菌平皿、活力很好的杂交瘤细胞、45℃水浴、2%琼脂糖生理盐水（用0.15mol/L NACl配置的2.0%琼脂糖，称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存）
利用杂交瘤制备单克隆抗体通常操作流程为：抗原制备、用抗原免疫动物、取免疫动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞、对杂交瘤细胞进行筛选及克隆化、利用筛选得到的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的大量生产。
用于制备单克隆抗体的抗原纯度越高，单抗制备实验的成功率越高。一般来说，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重组蛋白）、多肽、小分子等。
通常，根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠或大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。就小鼠而言，一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠。
免疫方案应根据抗原的特性不同而定，选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。没有一个免疫程序能适用于各种抗原，在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。现用的免疫程序与多克隆抗体制备的方法类似，免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射等。表1列举了目前常用的免疫程序:
| 免疫原特性 | 抗原量 | 接种次数及间隔时间 | 抗体滴度 | 亲和性 |
|---|---|---|---|---|
| 免疫源性强（如细胞、细菌或病毒等） | 106-107个细胞或1-10ug | 2-4次，每次间隔2-4周 | 高 | 中等至强 |
| 免疫源性中等 | 10-100ug | 2-4次，每次间隔2-4周 | 中等或高 | 中等或强 |
| 免疫源性弱 | 20-400ug | 先2-4次免疫，每次间隔一个月；然后2-3次免疫，每次间隔2-3月 | 中等 | 强 |
| 10-50ug(2次) 200-400ug(4次) |
先2次剂量A，每次间隔1个月；再4次剂量B，每次间隔1天 | 中等 | 中等 | |
| 10-100ug | 先2次免疫，每次间隔1个月；再4次免疫，每次间隔10天；然后“休息”1-2个月，最后加强 | 中等 | 中等或强 |
表1：常见的免疫程序
动物的免疫一般在融合前前两个月，根据确定的免疫方案开始对动物进行初次免疫。动物的免疫通常共有三次，在初次免疫2~3周后进行再次免疫，在再次免疫3周后进行加强免疫（如果有需要的话）。一般来说，在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。由不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此在注射抗原的同时，常常会加入佐剂，以增强抗原的抗原性，刺激机体产生较强的免疫反应。
脾淋巴细胞制备
已经免疫的BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠），在无菌条件下去除脾脏，并完成脾淋巴细胞的制备。
注意：制备脾淋巴细胞过程中，通常也会进行小鼠眼球摘除采血的的操作，将血清分离后作为抗体检测时阳性对照血清。
骨髓瘤细胞制备
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交瘤融合效率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAB。骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%~20%，细胞浓度以104~105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1:3~1:10的比例传代。每3~5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
饲养细胞
在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它细胞，则可使这些细胞生长繁殖，这种加入的细胞称为饲养细胞。在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入饲养细胞使之繁殖。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。
进行杂交瘤制备的具体操作方法有多种，这里介绍比较常用的一种，读者如果有兴趣可以在网上找其他的操作方法：
说明：上述步骤中，a~d为PEG介导的细胞融合，e~i为融合后的HAT筛选
融合细胞的筛选
脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。
所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。（相关阅读：杂交瘤细胞亚克隆常用方法）
杂交瘤细胞克隆化的意义
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已经不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系，也需要克隆化。另外，长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。
杂交瘤细胞制备单克隆抗体的过程中，通常将一部分杂交瘤细胞冻存起来备用，便于以后大规模生产单克隆抗体以及避免外部不可测的影响因素对实验带来过大的影响。（杂交瘤细胞的冻存与复苏）
利用杂交瘤细胞大量制备单克隆目前主要有两种方法，一种是动物体内生产法，另外一种是体外培养法。
鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠）的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物首选BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠）。将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，可得到大量的腹水单抗。该法操作简便、经济且抗体浓度很高。但是，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此得到的腹水抗体要提纯后才能使用。
体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。细胞体外培养一定时间后，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆。抗体相较于免疫动物生产单克隆抗体的方法，体外培养不需要对得到的抗体进行纯化，但该法的产量较低且费用昂贵。
检测抗体的方法有多种，根据抗体类型的不同，可以选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为优先。其中最常用的为酶联免疫吸附实验（ELISA）法。
ELISA的原理为：将使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，使抗体（或抗原）与某种酶连接成酶标抗体（或抗原），将待测抗体与酶标抗体（或抗原）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。最终结合在固相载体的酶标抗体量与待检测抗体的量呈一定比例。加入酶反应底物，底物被酶催化显色，根据颜色的深浅便进行定性或定量分析。
其它常用的方法有:
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