体外酶活检测

随着生物技术的迅速发展，酶的用途也越来越广，比如真核细胞培养用胰蛋白酶水解，药用胃蛋白酶等。但由于酶的本质是蛋白质，在运输储存过程中，其条件的变化阳光、颠簸、酸碱的侵蚀都会导致其活力的变化，从而影响实验的结果或其作用效果。

酶活检测方法

酶活指水解底物的能力，通过消耗底物的多少可知酶活大小，但一般底物都是过量的，所以可通过测定酶促反应中所生成的产物的量来确定酶活大小。依据反应中底物、生成物的理化特点，酶活检测方法可分为直接法和间接法。

• 间接法

1. 还原法在特定条件下，通过酶促反应分解底物，得到还原产物，该还原产物能与加入的化学试剂发生化学反应，生成有色物质。该颜色与含量成正比，可通过测量或对比观察有色物质或溶液的深浅，来计算出酶活大小。
2. 色原底物法用人工底物（底物与可溶性的生色物质结合的复合物底物）与酶发生反应，从而释放可溶性的生色基团物质，使溶液颜色发生变化。该颜色与含量成正比，所以可通过观察溶液颜色，来确定该物质的含量，从而得到酶活力的大小。部分人工合成色原底物和待测酶如下表：
   

   人工合成色原底物	待测酶
   4-硝基磷酸酚钠盐（PNPP-Na2）	碱性磷酸酶（ALP）
   2-氯-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷	淀粉酶（AMS）
   2-氯-硝基苯-α-岩藻糖苷	α-岩藻糖苷酶

3. 酶偶联反应法
   酶偶联法即在酶促反应中加入一个或多个工具酶，将底物转化为另一个可直接检测的物质，当工具酶的反应速度与待测酶的速度一致，即可用工具酶的反应速度代表待测酶的酶活。一般的酶都可以用偶联法，主要看哪种方法更方便。（注：偶联是一个化学反应发生时其它反应以化学计量学的关系相伴进行的现象。）酶偶联反应式部分待测酶及其底物如下表：

   待测酶	指示酶	底物
   腺苷脱氨酶（ADA）	谷氨酸脱氢酶(GLDH)	>腺苷
   淀粉酶	Α-葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶	淀粉

• 直接法

1. 高效液相色谱法
   在一定适宜条件下，让酶和其底物充分反应，取反应后溶液进行色谱分析，计算出生成物含量，根据酶的标准曲线，从而算出酶活力大小。
2. 琼脂凝胶扩散法
   将底物与熔融后琼脂混合均匀，倒入平板中，待其冷却至室温，用打孔器打出两个4mm左右半径的圆，分别加入待测酶样品和标准酶，并培养过夜后用展开剂显示出水解区。水解半径大小与酶活力大小成正比，故管观察其半径，可得酶活大小。
3. 粘度法
   某些特殊底物由于其本身粘度较大，通过特定酶的酶促反应后，其粘度会大大下降，所以可以用毛细管式粘度计测定其粘度的大小与标准添加酶的水平对比来判断酶活力的大小。该方法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。
   （注：毛细管式粘度计是一种常用的粘度计，其工作原理是：样品容器（包括流出毛细管）内充满待测样品，处于恒温浴内，液柱高度为h。打开旋塞，样品开始流向受液器，同时开始计算时间，到样品液面达到刻度线为止。样品粘度越大，这段时间越长。因此，这段时间直接反映出样品的粘度。）
   各种方法的比较

   方法	适用的酶	底物的选择	优点	缺点
   还原法	还原酶如硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氢化酶和N5,N10-亚甲四氢叶酸还原酶(FAD)等。	与还原酶对应的底物	简单、成本低、分析速度快	干扰严重，被测组分需要纯度较高，灵敏度低
   色原底物法	碱性磷酸酶（ALP）， 淀粉酶（AMS）， α-岩藻糖苷酶	4-硝基磷酸酚钠盐（PNPP-Na2）， 2-氯-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷， 2-氯-硝基苯-α-岩藻糖苷	成本低、分析速度快、重复性好	干扰严重，灵敏度低
   粘度法	纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶	如羧甲基纤维素钠、小麦阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖等	设备简单,操作方便	局限性大，一般只能用于检测催化底物粘度大的酶
   琼脂凝胶扩散法	水解酶类如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶等。	如淀粉、蛋白质、脂肪、磷酸等	于简单、易操作，不需要复杂的装置	培养时间长，一般需要一个晚上
   高效液相色谱法	无要求	无要求	检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广	分析成本高，液相色谱仪价格及日常维护费用贵

影响酶活检测的因素

1. 酶液稀释
   在测定酶活时，我们经常会稀释，并且我们把稀释后测得的酶活乘以稀释倍数，认为得到的是原本酶活大小，然而稀释会带来一些影响：①影响酶稳定性；②降低原有样品中辅助因子或抑制因子的浓度；所以实际上许多酶活大小与稀释倍数并不成比例，选择酶样的稀释倍数实际上就是选择酶分子与底物之间的数量比，而这只有在合适的范围，测定的酶活才与稀释倍数成比例。
2. 底物浓度
   在选择了适合的底物外,底物溶度也是不可忽视的影响因素，原则上底物浓度是不影响酶活，但底物浓度越高，酶促反应越快所代表的酶活越大；当底物浓度达到一定水平时，酶促反应将趋于稳定，所以在测酶活时，底物应超过这个临界值以饱和酶，从而使酶活大小与底物浓度无关，底物范围一般选择在10～20Km（米氏常数）。
3. 温度
   酶，对温度非常敏感，所以在检测过程中，要着重注意对温度的控制±1℃为好。温度对酶活的影响主要在两方面：一方面，温度升高，酶促反应速率加快，酶活上升；另一方面温度过高，酶变性而失活，酶活下降。所以要选择最适温度，才能准确地测出酶活大小，然而不同的酶，其酶活的最适温度可能截然不同，所以酶活测定的温度并不统一，但多数酶，其酶活最适温度在37～40℃。
4. pH值
   PH同温度一样，对酶活测定影响很大，过酸或过碱都会使酶空间结构遭到破幻，使酶活性部分催化基团和结合集团解离，使酶活丧失。但在一定范围内酶活又是随PH升高而增加，所以要选择最适PH才能准确测出酶活大小。
5. 辅助因子
   酶的辅助因子是与酶蛋白疏松结合的小分子量的有机物质或者是一些金属离子,例如锌离子是羧基肽酶和醇脱氢酶的辅基,锰离子是精氨酸酶的辅基。这些酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性,因此在酶活性测定时,就要保证辅基或辅酶的供给。
6. 激活剂和抑制剂
   有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高,例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂,Cl-是淀粉酶的激活剂.因此在酶活性测定时,也要满足酶对激活剂的需要。抑制剂顾名思义抑制酶活所以要减少它的出现。