重组抗体表达实验案例

概述：本文为重组抗体表达案例介绍，介绍了完整的重组抗体表达实验流程，包括实验设计、质粒抽提、CHO细胞复苏、CHO细胞转染、重组抗体纯化及稳定性检测等实验步骤及各个步骤的详细操作流程。

第一部分 实验设计

该案例为德泰生物重组抗体表达服务的一个项目,采用德泰生物最新开发的密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program (V13)对提供的重组抗体H（以下简称rAb-H）蛋白氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过双酶切法将将rAb-H基因插入到表达载体proEM中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性，最终转到DH5a克隆菌株中，通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒，之后将质粒通过转染试剂转染到哺乳动物细胞CHO中进行瞬时表达，在通过Protein A亲和层析纯化rAb-H蛋白。

第二部分 重组抗体rAb-H在哺乳动物系统中表达与纯化

一、转染级质粒扩增抽提

1. rAb-H质粒转化DH5a
   • 分别吸取rAb-H的Light Chain和Heavy Chain表达质粒80-100ng加入已制备的DH5a感受态细胞中;
   • 将加入质粒后的感受态细胞通过热激42℃，90s转化;
   • 将转化后的感受态细胞加入 LB液体培养基，放入摇床37℃，200rpm震荡培养约30nim;
   • 将培养后的感受态细胞取出，吸取部分悬液涂在含有氨苄抗性的平板上，放入培养箱，37℃，过夜培养;
   • 从新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mL LB培养基，37℃，200rpm培养8h;
   • 按1/500比例接种于200mL LB培养基中，37℃，200rpm培养16h;
   • 收集培养后的菌液离心，去掉上清.
2. rAb-H质粒抽提（Qiagen转染级质粒抽提试剂盒）
   • 1%琼脂糖凝胶分析抽提的rAb-H质粒，结果如下：
     
   • 转染级质粒DNA质粒质量测定

二、CHO细胞复苏与传代

• 提前将水浴锅打开37℃；培养基提前在37℃预热;
• 从液氮罐中取出冻存的CHO细胞；
• 把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其快速融化（约1min），取出；
• 用75%乙醇消毒管外壁，放入生物安全柜内,转移到含10mL培养基的 15mL离心管中，离心800 rpm，5 min；
• 离心后的细胞去掉上清，取少许新鲜培养基重悬细胞，再转移到培养瓶中，加入新鲜培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，使密度控制在3-4×10⁵ cells/mL，活力>95%；
• 置于培养箱中110rpm，37℃，5% CO2培养；
• 细胞培养2-3天，密度达到2.0×106 cells/mL 左右时需对细胞进行传代；
• 从培养瓶中取出部分培养物弃掉，再向培养瓶中补加新鲜培养基，对剩余的细胞培养物稀释（留下的细胞培养物根据细胞密度、培养体积、稀释后密度等而定）；
• 放入培养箱中110rpm，37℃，5%CO2，继续培养；
• 每天需对细胞密度及活力检测，当细胞密度达到2×106 cells/mL左右时，要对细胞进行传代；

三、rAb-H质粒转染CHO细胞

• 转染前2天将CHO细胞悬浮培养至1.5 L，接种密度为4 – 5×105 cells/mL，置于培养箱中110rpm，37℃，5% CO2培养；
• 转染当天使细胞密度控制在1.5-2×106 cells/mL；
• 将转染缓冲液、转染试剂等试剂提前放入培养箱或水浴锅37℃预热(10-20min)；（转染方法介绍）
• DNA-转染试剂混合物：向转染缓冲液中加入Light Chain和Heavy Chain表达质粒和转染试剂混匀，37℃温育10min；
• 将DNA-转染试剂混合物加入待转染细胞中，放入培养箱中110rpm，37℃,5%CO2培养；
• 收集：转染后约5-6天，取出细胞培养物，离心，收集上清或细胞；

四、rAb-H 纯化

• 取转染培养6天后的细胞培养液离心，上清用0.22um膜过滤，在4℃环境下透析至缓冲液20 mM Na2HPO4，150 mM NaCl，pH 7.0中，透析结束后再用Protein A柱纯化，结果如下：
  经Protein A亲和层析纯化，目标蛋白rAb-H主要存在于洗脱组分Lane 4-6中，收集上述目标蛋白，并将其透析到1XPBS, 10% Glycerol, pH7.4中,透析结束后用0.22um膜过滤，并分装冻于-80℃

第三部分 重组抗体rAb-H蛋白质检

1. rAb-H稳定性测试（冻融实验）

取一支分装后冻于-80℃的rAb-H蛋白，放置于冰水混合物中待其缓慢融化，融化后无异常现象，说明rAb-H蛋白冻融实验是正常的。

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