免疫原性（immunogenicity）是治疗性蛋白产品诱导机体产生免疫应答或诱导临床相关免疫不良反应的特性，可能影响药物代谢动力学、药效动力学、药物安全性和有效性。一般通过检测体液免疫产生的抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）评价大分子药物的免疫原性。对于不同的产品，ADA的产生可能不会引起明显的临床后果，也可能导致严重的不良事件，如过敏反应、与内源性蛋白交叉反应、中和内源性蛋白导致其功能丧失等。中和抗体（neutralizing antibody，NAb）是一种特殊的ADA，NAb通过阻断产品到达其靶标或干扰受体/配体结合，从而干扰药物的体内活性。因此，NAb是抗药抗体免疫原性研究和评价的重要组成部分。
抗体药物偶联物（antibody-drug conjugates，ADC）是一类新兴的抗癌治疗药物，借助单克隆抗体的特异性，靶向运送细胞毒素到肿瘤部位，不仅可以提高化学治疗的疗效，而且可以降低或消除细胞毒素分子对非靶组织、非靶细胞的毒性。ADC药物的单克隆抗体、连接子、连接子-细胞毒素分子、偶联引入的新的抗原表位均可能具有免疫原性，这使得ADC药物诱导机体产生的免疫反应较为复杂；ADC药物结构和作用机制的特殊性决定了NAb的检测及评价也与抗体类药物具有不同之处，面临更大的困难和挑战。
治疗性蛋白药物的免疫原性评价多为定性或半定量的试验，通常采用多层次的分析策略。第1步为筛选试验，确定潜在的阳性样本。第2步为确证试验，确认抗体的药物特异性。确证试验一般在筛选试验的基础上，加入过量的药物竞争性结合ADA，通过响应信号的降低确证抗体的特异性。第3步为通过滴度试验、中和活性试验、抗体分型/亚型试验、表位分析（结构域分析）或亲和力检测等试验确定ADA的滴度、中和活性、亚型、表位和亲和力等特点，以便更好地分析可能出现异常的药动学、药效降低、过敏等不良反应事件发生等情况。
ADC药物作为特殊的生物大分子，其免疫原性评价同样遵循上述策略。鉴于ADC药物的结构特点，推荐增加表位分析试验，评价针对单克隆抗体、连接子、连接子-药物等不同表位ADA的产生及其影响。ADC药物没有对应的内源性成分，所以针对ADC药物的免疫反应不会中和重要的内源性蛋白。
目前，桥连试验基本可以检测绝大多数类型的ADA，因此基于桥连的酶联免疫试验（ELISA）或电化学发光试验（ECL）多用于大分子药物ADA的分析。ADC药物的抗药抗体表位分析可采用竞争法或直接检测的方法。竞争法表位分析的原理与确证试验类似，也是采用过量未标记的ADC与样本预先孵育，再进行检测。直接检测法则选用ADC作为捕获试剂，靶向单克隆抗体或细胞毒素分子的抗体作为检测试剂，直接检测ADA的表型。
中和活性检测方法的分析模式的选择需要基于多种因素进行考虑，包括但不限于药物本身的作用机制、检测方法与体内真实情况的相关性、方法本身的选择性、生物基质的干扰程度、灵敏度和稳健程度等。对分析模式进行选择时，建议将测定方法与药物体内作用机制的相关性作为首要考虑因素。常规用于抗体类药物中和抗体分析的试验模式（format）分别为：基于细胞的生物学试验（cell based assay）、非细胞的竞争性配体结合试验(non-cel lcompetitive ligand-binding assay，CLBA)。试验模式的选择应该考虑药物的作用机制（MOA），试验的灵敏度、选择性、精密度、药物耐受性及产生的NAb对受试者的影响等因素。中和抗体检测方法开发的目的是检测临床相关的NAb，检测性能是试验模式选择的关键因素。若已选择的试验假阴性/假阳性率较高且与临床结果一致性较差，应考虑提高方法的性能；若因技术限制无法达到预期的标准，则可以考虑选择性能更好的试验模式。
ADC药物的单克隆抗体和细胞毒素等不同结构域按照一定的顺序参与细胞杀伤效应，靶向单克隆抗体或细胞毒素的NAb可能阻断ADC药物的细胞杀伤活性，因此单独采用细胞增殖、凋亡等细胞功能性试验，可较好地反映ADC药物的作用机制，用于评价ADC药物产生ADA的中和活性。鉴于ADC药物的作用机制，FDA，EMA等监管机构首推基于细胞的生物活性试验用于ADC药物的中和抗体分析。
细胞增殖过程中代谢酶活性增加，而ADC药物作用后细胞死亡或凋亡，酶活性降低。首先，根据ADC药物的作用机制，选择合适的细胞系、检测系统，进而建立细胞活性、毒性检测系统，即药物的活性曲线。然后，根据药物的活性曲线，确定适当的ADC药物浓度，样本中存在的NAb可以降低ADC介导的细胞活性或增殖抑制。最后，根据一定浓度ADC药物作用后细胞活性的改变，判定NAb存在与否。
以活细胞线粒体脱氢酶为基础的细胞试验：CCK8，WST-8，MTT，XTT，MTS等试剂可以被活细胞线粒体脱氢酶还原为有色的甲臜，甲臜的吸光度值与活细胞的数量成正比，可以采用商品化的试剂盒分析细胞的增殖或凋亡，建立抗ADC药物抗体的中和活性分析方法。
以蛋白水解酶等为基础的细胞试验：细胞中的蛋白水解酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等可用于定量分析活细胞、凋亡或死亡细胞，进而用于评价抗ADC药物抗体中和活性。多肽底物Gly-Phe-AFC可通过细胞膜，活细胞中蛋白水解酶可催化该底物产生可检测的荧光信号，根据此原理利用试剂盒检测活细胞的数量，可进而评价药物的活性。细胞死亡后释放蛋白水解酶，催化细胞非通透性底物bis-AAF-Ｒ110或AAF-aminoluciferin产生可检测的信号，通过释放的蛋白水解酶的催化活力评价药物的毒性。
细胞代谢的标志物，如三磷酸腺苷（ATP）、乳酸脱氢酶（LDH）等的浓度变化可作为检测指标用于评价细胞的活性。以细胞代谢物为检测指标的ADC药物活性分析方法，检测用药后代谢标志物水平的降低，降低程度与药物浓度呈正相关。样本中NAb与ADC的结合导致ADC药物活性降低，药物活性降低又引起代谢标志物水平的增加，增加程度与NAb的活性或浓度呈正相关。
基于细胞的中和抗体分析试验，通过ADC药物生物学活性被抑制评价抗药抗体的中和活性，比CLBA试验更能反映ADC药物体内发挥作用的情形。但细胞试验受基质或药物干扰较大，试验的灵敏度较低；样本的酸解处理可能会影响细胞的活性，因此在一些情况下，如经过充分的论证，也可考虑采用CLBA进行ADC抗药抗体中和活性分析。CLBA是基于NAb与药物靶蛋白竞争性结合药物，若样本中含有NAb，则表现为药物与靶蛋白的结合被一定程度抑制。CLBA试验系统通常较基于细胞的试验系统有更高的灵敏度、精密度，良好的药物耐受，还可耐受较强的基质干扰。
目前经FDA和EMA批准上市的Adcetris和Kadcyla以及部分处于临床研究的ADC药物，分别以ADC药物或BSA偶联的细胞毒素分子包被酶标板或电化学发光板，采用桥连等方式检测抗ADC药物或抗细胞毒素分子的抗体，评价抗药抗体的免疫原性。借鉴上述ADC药物ADA的分析方法，采用ADC药物或细胞毒素分子包被反应板，随后应用标记的抗原或抗细胞毒素分子抗体进行竞争性结合，从而评价ADA的中和活性，并检测抗药中和抗体识别的表位。
ADC药物中和抗体试验方法的开发存在的挑战包括：基于细胞的抗体难以区分抗体的表位、难以选择合适的阳性对照抗体、细胞系的变异较大、基质中的药物干扰较大等。
基于细胞的中和抗体分析试验，一般选择对药物较为敏感且能够耐受较高基质干扰的细胞系。但细胞经多次传代后，可能会丢失基因或改变基因型，研究人员应考察细胞系稳定的传代次数，降低试验的变异性。针对基质干扰，可在方法开发时确定最小稀释倍数，通过对样本的稀释，消除或降低基质的干扰。FDA推荐的最小稀释倍数为5～100倍，过大的稀释倍数可能导致假阴性结果的出现。
ADA可能包含靶向单克隆抗体、连接子、连接子-药物、新表位的中和抗体，而靶向不同表位的中和抗体可引起不同的细胞反应。针对单克隆抗体的NAb可阻断ADC药物与靶抗原的结合，导致受体介导的内化失败，表现为相较于药物对照组细胞活性升高。针对细胞毒素或连接子-细胞毒素的NAb内化进入靶细胞后，可能在溶酶体的特殊环境中被酸化、酶催化而释放细胞毒素，不影响细胞毒素发挥作用，表现为相较于药物对照组药物活性无改变。存在相反的情况，即针对细胞毒素或连接子-细胞毒素的中和抗体以免疫复合物的形式被内吞、进入溶酶体后仍可结合于细胞毒素分子上，从而抑制细胞毒素的杀伤效应，表现为相较于药物对照组细胞活性升高，与第一种情况相似。NAb具有结合游离细胞毒素和ADC药物各功能域的能力，导致非靶组织因发挥免疫复合物清除功能摄取免疫复合物而中毒。因此，基于细胞的抗ADC药物中和活性分析不能检测到所有类型的中和抗体，可能低估中和抗体的存在。
中和抗体检测结果高度依赖于试验的灵敏度和特异性，高灵敏度、特异性、选择性的试验方法则高度依赖于阳性对照抗体的选择。来源于抗药中和抗体阳性受试者的抗体是阳性对照抗体的最佳选择，但是获得足够的此类阳性对照抗体非常困难，因此分析方法开发和验证过程中使用的阳性对照抗体多数来源于实验动物，如兔、小鼠等。目前，多采用药物免疫试验动物，获得抗独特型的多克隆抗体或单克隆抗体作为阳性对照抗体。同一种试验方法，采用较高亲和力的阳性对照抗体可获得较高的灵敏度、相对较好的选择性和特异性。德泰生物抗独特型多/单克隆抗体制备服务，抗体亲和力高，特异性好，保证下游试剂盒开发灵敏度，为生物药研发解除限速。
ADC药物为多结构域药物，各结构域均可能引起机体的免疫反应。制备针对ADC整个药物或单抗的阳性对照抗体较为容易，而制备针对细胞毒素小分子、连接子-细胞毒素分子等半抗原的具有中和活性、高亲和力的阳性对照抗体则存在较大挑战。德泰生物小分子抗体制备服务，从半抗原改造、半抗原载体偶联、动物免疫、抗体筛选与功能验证到抗体生产纯化的一站式服务；服务基于SingleB®快速单抗发现平台，筛选通量大，获得的抗体亲和力更高，检测灵敏度更佳。此外，ADC药物在连接后可能形成新的免疫原性表位，由于缺乏对这类表位的了解，因而制备针对此类抗原抗体的难度很大。鉴于此，几乎不可能实现表位特异的抗药抗体中和活性分析。
由于阳性对照抗体来源于动物，所以真实样本的中和抗体谱与阳性对照抗体存在差异，阳性对照抗体的中和活性并不能代表真实的NAb中和活性。因此，采用阳性对照抗体建立的试验方法的灵敏度、耐药性等参数仅能作为参考。
CLBA试验采用靶蛋白与NAb竞争性结合药物的原理对中和抗体进行分析评价。靶蛋白的纯度以及与内源性蛋白性质的相似性是影响试验参数的重要因素。基于检测原理及样本处理的需要，对ADC药物进行生物素、Sulfo-tag等标记时需考虑下列问题：（1）标记位点被连接子占据致使标记效率低或标记失败；（2）标记导致ADC的聚合倾向性增加，降低ADC的稳定性和免疫学活性；（3）高比率的标记可能掩盖ADA和NAb的识别表位。
机体循环系统中往往既含有游离药物、游离ADA，又含有药物-ADA免疫复合物。基质中游离药物对免疫原性检测往往产生干扰，而ADA-药物免疫复合物的存在则导致NAb漏检率增加。长期、多次给药后，样本中通常存在高浓度的游离药物或药物-ADA免疫复合物，导致假阴性率明显增加。由于阳性对照抗体的性质、试验设计、药物浓度等因素都对试验方法的耐药性存在一定影响，因此不可能确定多种因素下的药物耐受水平。通过在消除相采集样本或酸解处理样本，在某种程度上可增加检测的准确性和提高药物耐受水平。但ADC药物给药后样本酸解处理需注意下列问题：（1）采用酸敏感连接子制备的ADC不能进行酸解处理；（2）方法中采用的阳性对照抗体和样本中真实NAb的酸敏感性不同，检测的不确定性增加。（3）经酸解、中和后的样本溶液，可能会改变细胞培养基的渗透压或pH，不利于细胞生存，继而导致非药物作用的细胞死亡，使试验结果的假阳性率增加。
基质中可能存在的游离靶点可与NAb竞争性结合药物，发挥与中和抗体相同的降低药物活性的作用。个体基质中的游离靶点可因不同季节，受试者或患者患病状态、年龄、性别等因素有较大水平的波动，因此方法学验证时应考虑游离靶点对确定临界值产生的干扰。同理，样本检测中也应考虑样本中不同浓度的游离靶点可能导致假阳性率增加。此时，可考虑增加样本处理步骤，清除基质中游离靶点，降低或清除靶点干扰。
ADC药物因其高特异性的靶向治疗受到越来越多的关注。随着ADC药物的增多，积累的ADC药物免疫原性评价的经验可用于评估采用同样连接子、细胞毒素分子和同样药物-抗体比率连接的ADC药物的临床免疫原性风险，判读ADA和NAb产生的趋势以及预测ADA和NAb识别的表位。同时也应认识到，每种ADC药物的免疫原性风险与其采用的单克隆抗体、连接子、细胞毒素及其裂解方式、受试者免疫状态等因素有很大关系，单个ADC药物的免疫原性评价方法和结果仅作为该类药物免疫原性检测方法设计和开发时的借鉴，尚不能为其他ADC药物免疫原性风险评估策略的制定提供直接参考。因此，必须评估每种ADC药物的免疫原性风险，加强对检测方法的开发和优化，指导药物研发，增加用药安全性。此外，ADC药物靶向运送细胞毒素的特性，启发新的结合性靶向治疗大分子的产生，如靶向传染性病原体的抗体-抗生素结合物、靶向炎症的抗体-糖皮质激素结合物等，这也将为ADC药物免疫原性评价带来新的挑战。
参考文献
[1]宫新江,满素勤,邵雪,等.抗体药物偶联物抗药抗体中和活性分析研究进展[J].中国新药杂志, 2019, 28(21):2573-2580.
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