骆驼科动物Ig V基因同源性分析

在过去的20年中，治疗性抗体已成为治疗恶性、感染性和自身免疫性疾病的重要选择。凭借高特异性、治疗功效、稳定性、溶解性、临床耐受性和相对便宜的生产成本，单克隆抗体在靶向治疗领域实现了飞跃。

免疫原性即生物制剂诱导体液或细胞介导的免疫反应的能力，长期以来一直是治疗性抗体的“致命弱点”。治疗时非人抗体通常会被患者的免疫系统识别为外来抗体，导致治疗性抗体或其衍生物的快速清除，限制了疗效。嵌合抗体通过使用人抗恒定区取代鼠抗恒定区，以尝试降低免疫原性。在CDR移植抗体中，可变区的人源化程度进一步增加，帮助免疫原性特征显著改善。然而人源化甚至完全人源抗体在患者中或多或少具有免疫原性的问题仍有待解释。

与天然人源抗体相比，大多数人源化抗体的CDR区表现出不同的结构折叠组合，这为诱导针对治疗性抗体的不良免疫应答提供了合理的解释。这些规范结构（canonical structures）被证明对于在人源化抗体时保持亲和力至关重要，也开辟了超级人源化的方法，可以将鼠抗与人抗规范结构进行匹配。基于抗体的疗法突破的一个重要驱动力是人类、啮齿动物和其他物种种系免疫球蛋白（Ig）重链和轻链（V，（D），J和C）基因的测序/表征。它揭示了Ig库的广泛多样性，并解释了其识别和结合几乎任何具有不同亲和力水平的抗原的能力。现在有许多产生人类治疗性抗体的抗体发现平台可用，包括转基因小鼠系统以及可以通过各种展示技术筛选的非免疫和合成人抗体库。

骆驼科动物抗体V区序列同源性

基于已发表的美洲驼和单峰驼体内成熟常规抗体的VH区域，研究人员注意到骆驼科动物与人类抗体序列高度的同源性。根据全基因组鸟枪数据库（WGS）和高通量基因组测序数据库（HTG）中骆驼和羊驼数据，各自框架FR1、FR2和FR3的一致性，CDR1和CDR2的长度，以及规范结构的预测结果表明，骆驼科动物和人类抗体V基因库具有序列同源性。规范结构预测基于Chothia规范，除了CDR的长度之外，还考虑了CDR和FRs中关键残基的存在。此外，比对表明，在不同的骆驼物种之间，IGHV、IGLV和IGKV基因是同源的（有时甚至是相同的），并且共享相同的V区家族和亚家族。

IGHV基因库

骆驼科动物IGHV基因库主要包括VH1、VH3、VHH3和VH4基因家族。除了IGHV1、IGHV3、IGHV4基因家族外，还存在属于IGHV5和IGHV7基因家族。所有五个V基因家族都与人类对应基因家族高度同源。IGHV1基于匹配的规范结构1-2（HCDR1和HCDR2）进行鉴定，这些结构与人类种系hIGHV1-1、1-2、1-3相关。IGHV3家族确定了2个亚家族，可以根据其CDR2残基组成将其细分为4组（a-d）。IGHV3两个亚家族分别与具有规范结构1-3和1-1的hIGHV3-23和IGHV3-66相关。VHH3是骆驼科所特有的，根据1-3和1-1的规范结构，可分为2个亚家族，一个亚家族与hIGHV3-30/hIGHV3-11相关，一个亚家族与hIGHV3-66相关。在IGHV4家族中，可以鉴定出两个亚家族：一个与hIGHV4-30-4相关，规范结构为3-1；另一个与hIGHV4-30-4具有相同的HCDR1长度，但HCDR2不同，这可能导致与人类胚系IGHV4对应的规范折叠不同。IGHV5和IGHV7家族与人类IGHV5-51和IGHV7-4基因具有相同的规范结构1-2。

骆驼科动物IGHV1和IGHV3与人类IGHV家族的FR一致性92%~95%，IGHV4一致度至少82%。骆驼科动物IGHV5和IGHV7的FR序列一致性较低，但仍有77%。进一步分析显示，VHH3和VH3基因分别包含FR2的亲水性氨基酸残基替换（F42/Y42, E49/Q49, R50/C50和F52/G52/L52）和疏水性氨基酸替换(V42/I42, G49, L50和W52/S52)。

图1 骆驼科动物IGHV框架区与人抗相似度比对

IGLV基因库

骆驼科动物IGLV1家族由2个与hIGLV1-47和hIGLV1-40相关的亚家族组成，分别包含规范结构13-7和14-7。发现的大多数骆驼科动物IGLV2家族与hIGLV2-18有关，规范结构为14-7。IGLV3包含两个亚家族：一个与hIGLV3-9更相关，而第二个可以进一步分为3个与人类IGLV3-25相关（两者都具有规范结构11-7）。IGLV4家族可分为5个亚家族，且均与hIGLV4-60最相似，规范结构为14-11。IGLV5家族中10个亚家族与hIGLV5-39，hIGLV5-52，hIGLV5-37，hIGLV5-45一致性较高，所有亚家族（亚家族8除外）共享相同的14-11规范结构。IGLV6基因与hIGLV6-57相似，由于过早终止密码子，无法确定规范结构。IGLV7基因仅在骆驼和羊驼基因组中鉴定出，并被证明与hIGLV7-46相关，规范结构为14-7。IGLV8和IGLV9分别由8个亚家族和2个亚家族组成，分别与hIGLV8-61和hIGLV9-49相关，规范结构分别为14-7和12-12。IGLV10家族与hIGLV10-54相关，具有相同的规范结构13-7。

三种主要的人类IGLV家族（1-3）与骆驼科动物IGLV高度同源，基于FR的序列同一性在81%~91%。有趣的是，尽管总体一致性在61%到91%之间，但所有规范结构都与人类V区家族相匹配。此外，关键位点残基保守不仅局限于框架区，而且还扩展到CDR区，骆驼和人类V区基因之间框架区的这种高序列和结构相似性在免疫原性方面可能非常重要。

图2 骆驼科动物IGLV框架区与人抗相似度比对

IGKV基因库

骆驼科IGKV库由6个家族组成，骆驼科IGKV1家族拥有三个亚家族，与hIGKV1-27和hIGKV1-39相关，并具有相同的规范结构2-1。IGKV2家族拥有两个亚家族，与hIGKV2-29和hIGKV2-40相关，分别具有规范结构4-1和3-1。IGKV3和IGKV4亚家族分别与hIGKV3-11、hIGKV4-1相关，分别具有规范结构2-1和3-1。IGKV5和IGKV6家族与hIGKV5-1和hIGKV6-41相关，均基于2-1规范结构。

骆驼科IGKV基因与人类基因的同一性百分比在60%至85%之间，其中IGKV3基因的相似性最低。除了IGKV5，鼠IGKV基因与人类基因的亲缘关系更密切。同时，一致性不仅限于框架区，CDR区也是如此。

图3 骆驼科动物IGKV框架区与人抗相似度比对

骆驼科动物抗体V区规范结构预测

为了进一步证实骆驼科动物抗体和人类抗体V区之间结构同源性，研究人员通过X射线晶体学确定两种骆驼科抗体的结构。这两种抗体是从使用人CD70或MET过表达细胞主动免疫的美洲驼制成的噬菌体展示抗体库中分离的。CD70（一种膜结合细胞因子）和MET（一种酪氨酸激酶受体）在肿瘤生长/存活、血管生成和转移中起重要作用。通过对获得的美洲驼抗体X射线晶体学进行结构测定，抗CD70（PDB 4R90; VH3/Vλ7）和抗MET（PDB 4R96; VH1/Vκ4）抗体结构分析见图4。

如图4C和4D，美洲驼抗MET（VH1/ Vκ4）单抗的环状结构与人类的重链和轻链（以PDB结构1FVD和1HIL为模板）相似。模板1FVD Fab中的HCDR1和HCDR2的规范结构1-2与抗MET Fab（属于IGHV1家族）的规范结构非常吻合，这意味着它确实利用了与匹配的人类种系VH1片段相同的规范折叠组合。此外，在1HIL模板中，LCDR1，LCDR2和LCDR3（灰色）的规范结构3-1-1分别与抗MET抗体的Vκ片段（蓝色）完美重叠。这证实了美洲驼衍生的IGKV4与人类IGKV4片段使用相同的规范折叠。总之，结构数据明确地证实了在骆驼科来源抗体的可变区域中存在的人类抗体的规范折叠。

图4 美洲驼重链和轻链V域和对应人抗的晶体结构

(A)美洲驼抗CD70抗体 VH（黄色核心，红色H1和H2，橙色CDR3)与人抗（1MFA，灰色）叠加效果图
(B)美洲驼抗CD70抗体 VL（粉色核心，绿色H1-H3)与人抗（灰色）叠加效果图
(C)美洲驼抗MET抗体 VH（绿色核心，蓝色H1-H2，红色CDR3)与人重链参考物1FVD（Vκ1）和1HIL（Vκ4）（灰色)叠加效果图
(D)美洲驼抗MET抗体 VK（绿色核心，蓝色H1-H3）与人重链参考物1HIL（Vκ4）（灰色）叠加效果图

参考文献
Alex Klarenbeek, Khalil El Mazouari, Aline Desmyter, et al(2015) Camelid Ig V genes reveal significant human homology not seen in therapeutic target genes, providing for a powerful therapeutic antibody platform, mAbs, 7:4, 693-706, DOI: 10.1080/19420862.2015.1046648

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