免疫胶体金技术

免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique, ICG）是一种常见的标记技术，它是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术，是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，因其快速简便、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点已在体外诊断、食品安全、环境监测等领域取得广泛的应用，如妊娠试验、传染病病原抗体的检测、蛋白检测和药物测定等，其在兽医临床上的应用也日益广泛。

胶体金技术的基本原理

氯金酸（HAuCl₄）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体体系，故称胶体金。胶体金颗粒散在，直径从几纳米到几十纳米不等，由于不同直径的胶体金的光散射各异，所以其溶胶颜色的深浅相应发生显著的变化。

胶体金标记实质上是蛋白质等大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒，这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合，从而使其成为免疫反应的优良标记物。

图1 胶体金结构图

免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性，在显微镜下金标蛋白结合处，可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可用于定性或半定量的快速免疫检测，而且金颗粒还可催化银离子还原成金属银，在胶体金免疫测定时加入银染色液，能放大反应信号，大大增加测定的灵敏度。

胶体金技术的发展

1857年，法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金，并发现在其中加入少量电解质后，可使胶体金由红色变为蓝色，最终凝集成无色，而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化，奠定了胶体金制备和应用的科学基础。
1971年，Faulk和Taylon首次用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，制备成金标抗体检测细菌表面抗原的分布。
1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术得到很快发展。
1980年，Geoghegan应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金技术（immune gold staining, IGS）。
1983年，Danscher在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法。Holgate又对此法加以改进，将免疫金染色与银显影技术相结合，建立免疫金银染色法（immune gold silver staining, IGSS）。

近年来，研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。目前已广泛应用于被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、流式细胞术、液相免疫测定、斑点金免疫渗滤及免疫层析等，其中在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（immune chromate graphic assay, ICA）和斑点免疫金渗滤法（Dot immune gold filtration assay, DIGFA）。

胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析技术近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。胶体金免疫层析试纸条主要是将特异性的抗原或抗体以条带状包被在NC膜的检测T线上，胶体金标记的抗原或抗体吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的加样孔上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记的抗原或抗体，再移动至包被的抗原或抗体的检测线处，如果样品中含有相应的抗体或抗原，包被在检测线上的抗原或抗体和胶体金标记物与样品中的相应抗体或抗原结合，形成免疫复合物，胶体金富集在检测线处形成一条可见的紫红色线。如果待检血清中没有相应抗体，胶体金标记物将不会与包被在检测线上的抗原或抗体结合，胶体金不会富集，检测线上不会出现紫红色色线。当样品与胶体金标记物继续往上移动至质控线时，就与包被在质控线处的特异性抗体或抗原结合，在质控线上形成免疫复合物，出现一条胶体金富集的紫红色色线。

图2 胶体金免疫层析试纸条结构图

这种检测技术具有操作简单快速，特异性、敏感性好，可单份测定，结果直观，无须特殊仪器等优点，适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，具有巨大的发展潜力和应用前景。

常用的胶体金免疫层析检测方法有双抗夹心法、竞争法、间接法。

• 双抗夹心法

此方法常用于检测生物大分子和颗粒抗原。需要制备分析物的配对抗体，包被抗体用胶体金标记，固定在结合垫上，捕获抗体固定在NC膜的检测线上。此外，还需要制备与金标抗体特异性结合的二抗，固定在NC膜的质控线上。

图3 双抗夹心法

• 竞争法

此方法常用于小分子抗原的检测。将胶体金标记的检测抗体固定在结合垫上，待测抗原固定在NC膜的检测线上，同时需要将金标抗体特异性结合的二抗固定在质控线上。

图4 竞争法

• 间接法

此方法主要用于抗体的检测。将能与抗体非特异性结合的Protein A用胶体金标记后固定在结合垫上，与待测抗体特异性结合的抗原固定在NC膜的检测线上，并将抗Protein A的抗体固定在NC膜的质控线上。

斑点免疫金渗滤法

斑点免疫渗滤技术是20世纪80年代中期从固相酶免疫测定技术发展起来的较简便的固相标记免疫测定方法，该技术主要应用NC膜作载体的免疫检测技术，先将抗原或抗体点于NC膜上，封闭后加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。通过金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体NC膜上显示出来。与间接过氧化物酶法相比，免疫胶体金斑点渗滤法要更为敏感。

免疫胶体金技术的优势

胶体金制备容易，价格低廉。免疫金标记不仅可用于常规光镜，而且还可用于荧光显微镜，运用光镜的IGSS法是迄今最敏感的免疫组化方法。由于金颗粒具有很强的激发电子能力，还可用于扫描电镜和X射线衍射分析等。胶体金可以标记多种生物大分子物质，如抗体葡萄球菌蛋白A(SPA)、凝集素、多糖、多肽及其它蛋白质而不影响其生物活性。免疫胶体金对组织细胞的非特异性吸附作用小，故具有较高的特异性。胶体金是高电子密度颗粒性标记物，电镜下分辨率高，对超微结构遮盖少，并易与其他颗粒性结构相区别，具有较精确的定位能力。金颗粒大小可以控制，颗粒均匀，可进行双重和多重标记，即用不同大小的金颗粒分别标记不同的抗体，实现在同一张切片上观察两种以上的抗原，也可以和其他标记物配合进行双重或多重标记。由于胶体金本身有鲜艳的橘红色，可用光镜或肉眼观察试验结果，也可用分光光度计测定光吸收，进行定量分析。可在切片不同视野中根据金颗粒的数目来半定量抗原。应用于快速检测技术还具有操作简单快速，特异性、敏感性好，可单份测定，结果直观，且可保存试验结果，无须特殊仪器等优点。

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