双分子荧光互补技术

细胞内蛋白质之间的相互作用或形成蛋白复合物在细胞的生命活动过程中起着重要的作用，目前有多种手段能够实现蛋白质相互作用的研究，如免疫共沉淀、GST pull down、表面等离子共振、酵母双杂交等。本文主要对一种近年来发展起来的蛋白质相互作用研究方法—双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)技术做一介绍。

双分子荧光互补技术是一种基于蛋白质互补技术发展起来的，能够用于体内或体外检测蛋白质相互作用的技术。其实验原理是将荧光蛋白在合适的位点切开，形成不发荧光的两个多肽（VN及VC），这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白且在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。随后分别将两段多肽与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，如果诱饵蛋白和捕获蛋白能发生相互作用，那么两段不完整的荧光报告蛋白片段就会彼此靠近，重新形成具有活性的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时能产生荧光。最后通过荧光显微镜观察是否存在荧光，即可判断诱饵蛋白与捕获蛋白是否存在相互作用。

BiTC技术原理

BiFC优缺点

优点：

灵活：既能够用于体内相互作用的研究，也能够用于体外相互作用的研究；
快速直观：能够在显微镜下直接观察到相互作用结果；
适用性广：BiFC系统已经被成功应用于动物，植物，真菌和细菌等不同的宿主细胞中；
背景干净，灵敏度高：验证结果只需检测荧光的有无，背景干净，灵敏度高；
能够检测弱相互作用及瞬时相互作用；
对仪器要求低，成本可控，数据处理相对简单；

缺点

对温度敏感：温度高时片段间不易互补形成完整的荧光蛋白，这会对研究细胞在生理条件下的相互作用带来负面影响（目前，只有基于venus、citrine和cerulean的BiFC系统可以在生理温度条件下实现片段互补）；
信息滞后，无法随时观察：BiFC系统想要检测到荧光，需要经过两个荧光蛋白片段互补重新形成完整的活性蛋白，以及荧光蛋白自体催化两个过程，该过程往往需要几分钟到几小时，因此观察荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不能实时地观察相互作用过程；

技术背景

蛋白质互补技术

BiFC是基于蛋白质互补技术发展起来的。所谓蛋白质片段互补技术(protein fragment complementation)是将某个功能蛋白切成2段，分别与另外2种目标蛋白相连形成2个融合蛋白。在一个反应体系中，如果2种目标蛋白存在相互作用，则使得2个功能蛋白质片段靠近、互补并重建功能蛋白质的活性，通过检测功能蛋白的活性即能够判断两种目标蛋白是否存在相互作用。

BiFC在沿袭蛋白质片段互补技术的基础上进行了优化，蛋白质互补技术中功能蛋白的活性由底物反应所体现，通过检测底物变化，来判断蛋白质的相互作用；而BiFC技术则是利用荧光蛋白本身能够自我催化形成荧光活性中心并产生荧光蛋白的特征光谱的特点，直接反映蛋白质之间的相互作用，技术过程更加简单，结果更加直观。

用于BiFC系统的荧光蛋白

目前常用于BiFC系统的荧光蛋白有GFP(greenfluorescentprotein，绿色荧光蛋白)、YFP(yellowfluorescentprotein，黄色荧光蛋白)、CFP(cyanfluorescentprotein，青色荧光蛋白)、BFP(bluefluorescentprotein，蓝色荧光蛋白)、RFP(redfluorescentprotein，红色荧光蛋白)、Venus、citrine、cerulean、mCherry等。

Venus是目前最常用于BiFC分析的荧光蛋白，因为其荧光强且背景敏感度低，是BiFC系统理想的荧光蛋白。

BiFC系统的扩展

多色荧光互补技术

2003年，Heinemann U等人在BiFC的基础上建立起了多色荧光蛋白互补技术（multicolor fluorescent complementation analysis）。利用多色荧光蛋白互补技术能同时检测一个细胞中多组蛋白的相互作用，其实验原理是将多个荧光蛋白（GFP、CFP、BFP等）分别在特定位置切开后与目标蛋白连在一起形成融合蛋白，然后将这些融合蛋白混合。不同的目标蛋白间会发生相互作用，同时使不同的互补荧光蛋白片段结合，形成多个蛋白复合体，通过荧光显微镜可观察到不同颜色的荧光，从而判断多组蛋白间的相互作用。同时，多色荧光互补技术还能够通过荧光的强度对不同组蛋白之间的相互作用强弱进行比较。

BiFC-FRET

2008 年，Shyu YJ等人将BiFC技术和 FRET 技术结合，建立了基于双分子荧光互补的荧光共振能量转移技术(BiFC-FRET)，利用该系统能够检测3个蛋白之间的相互作用。BiFC-FRET系统由基于venus的BiFC系统和青色的荧光蛋白cerulean。其实验原理为：将两个目标蛋白分别和venus荧光蛋白的N，C端片段相连，两目标蛋白的相互作用使得venus蛋白重建（BiFC系统）。将第三个目标蛋白与cerulean构建融合蛋白，如果该融合蛋白能够与两个目标蛋白的异源二聚体发生相互作用，则cerulean可以作为供体将能量共转移至重建后的venus荧光蛋白，实现3个蛋白质相互作用的共检测（FRET技术）。

BiFC-FRET系统

BiFC-YTH

2011年，Zheng HY等人将基于GFP和YFP的BiFC系统和酵母双杂交（YTH）技术联用来研究萝卜花叶病毒在酿酒酵母、植物和昆虫细胞中的自我相互作用。BiFC可以弥补YTH技术不足的方面，例如有些外源蛋白在酵母体内处于不同的位置，几乎没有可能发生相互作用，而BiFC技术可直接观测到细胞中蛋白质问相互作用的位置。

BiFC系统应用

研究蛋白质相互作用

研究蛋白质相互作用是BiFC系统最主要应用，迄今各种BiFC系统已经被成功用于多种蛋白质的相互作用，例如体外、病毒、大肠杆菌、酵母细胞、丝状真菌、哺乳动物细胞、植物细胞、甚至个体水平的蛋白质之间相互作用研究。除了能够验证蛋白质之间是否存在相互作用，BiFC系统还能够对细胞内蛋白相互作用位置进行研究。