细胞生长曲线绘制-MTT法

摘要：通过MTT法可以得到细胞的生长曲线，也可对瞬时转染后的细胞进行检测，本文主要介绍了MTT的作用原理及实验操作要点。

MTT全称3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT主要有两个作用：① 药物（或其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定（如细胞瞬时转染表达后可对细胞进行MTT检测）② 用于细胞增殖及细胞活性的测定，可以制得细胞生长曲线。

MTT法检测细胞存活和生长的主要机理是：活细胞中的某些物质（线粒体中的琥珀酸脱氢酶）能够和MTT反应，使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（图1）并沉积在细胞中，而死细胞没有此功能。DMSO（二甲基亚砜）能够将此结晶（蓝紫色甲瓒）溶解，在酶联免疫检测仪490nm波长处测定其吸光值，能够间接的反应活细胞的数量。一定范围内，蓝紫色结晶沉淀的数量与细胞数成正比。目前MTT法因其灵敏度高，经济快速等优势被广泛的运用于细胞毒性试验，肿瘤药物的筛选、放射敏感性测定和对某些生物活性因子的活性检测等方面。MTT法也有自身的缺点，如MTT检测生产的蓝紫色产物（甲瓒）不溶于水，需被溶解后才能检测。一方面使得工作量增加，另一方面对实验结果的准确性产生一定的影响，且用于溶解甲瓒的有机溶剂对人体有一定的危害。细胞瞬时转染表达后的细胞也可做MTT实验，多数人不知道是先转染再做 MTT，还是先做MTT再进行瞬时转染，这里建议是先做转染，培养一段时间后（24/48h），重新接种至96孔板，加药两天左右，再进行MTT检测。

MTT法绘制生长曲线

水不溶性的蓝紫色甲瓒

实验准备

仪器：酶联免疫检测仪，血球计数板，96孔板，离心管等
试剂：MTT溶液，胰蛋白酶，DMSO（二甲基亚砜），血清培养基
MTT 溶液的配制
用PBS缓冲液溶解MTT粉末。PBS（ ph=7.4）配置：Nacl （8g）+ Kcl（ 0.2g）+Na₂HPO₄ （1.44g）+KH₂PO₄ （0.24g）调pH 7.4,定容至1L。
此处MTT 的浓度为：5mg/ml。称取 0.5克MTT粉末，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤除去溶液里的细菌。在配制和保存的过程中，最好避光。如在超净台中配置该溶液，可将日关灯关掉操作，同时容器用铝箔纸包住(避光)，4℃ 避光保存即可。使用勿超过两周，一旦MTT变色，即刻停止使用。建议是MTT最好现用现配，分装一定量的MTT粉末在EP管中，用的时候现配直接加到细胞培养板中操作方便也避免浪费。
此外，MTT具有致癌性，无论是配置还是实验都要注意做好防护准备。MTT对菌敏感，配置或保存的时候要保证无菌，且要避光。

在进行实验时，由于实验作用时间较短，因此可不避光，但是要将超净台的日光灯关掉，效果会更好。

实验操作

常规消化细胞，离心收集细胞沉淀，用血清培养基悬浮细胞，制成单细胞悬液，并用进行细胞计数
接种细胞：稀释细胞浓度至1×10⁴ /ml。吸取200ul的细胞悬液加入到96孔板中（注意设置空白对照组）
对于瞬时转染的细胞，转染后24h消化细胞，重新接种至96孔板，培养18h加药两天后进行MTT检测
细胞培养：常规培养细胞，每两天换一次液
呈色：从细胞培养第二天开始，即可每天按照固定时间取出96孔板并加入MTT溶液20ul，37℃培养4h后，将孔中上清小心的吸去，加入150ul的DMSO，震荡10min，使沉淀充分溶解
在酶联免疫检测仪上设置490nm波长测定吸光值，进行检测并记录结果（取平均值）
每天取出96孔板重复操作，并记录结果
以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线