胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下形成的纳米级金颗粒(直径1~150nm)分散体系,其颜色随粒径变化呈现橙黄色至紫红色。胶体金因具有高电子密度、稳定性及与生物大分子(如抗体、抗原)的静电结合能力,被广泛应用于免疫检测、生物标记及诊断试剂开发。
制备颗粒均匀、分散度好的胶体金非常关键,胶体金颗粒直径的变异范围太大会影响试验的稳定性和重复性。如胶体金颗粒的形状不规则或粒径不均一,胶体金标记物容易解离、沉淀,从而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象。胶体金的制备过程中的细节关乎制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作区。所用玻璃容器必须绝对清洁,玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成,产生凝集颗粒,玻璃器皿用前要经过酸处理、超声洗涤处理,并用蒸馏水、超纯水依次冲洗浸泡,然后烘干备用。
胶体金的制备一般采用还原法,其原理是利用还原剂将氯金酸溶液中的金离子还原成金原子。常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等,根据还原剂类型以及还原作用的强弱,可以制备5~150nm不等的胶体金。一般还原剂用量越大制备的胶体金颗粒越小。如制备颗粒直径在5~12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸,制备大于12nm直径的胶体金则用柠檬酸钠。
粒径(nm) | 0.01%氯金酸(mL) | 1%柠檬酸三钠(mL) |
---|---|---|
16 | 100 | 2.00 |
24.5 | 100 | 1.50 |
41 | 100 | 1.00 |
71.5 | 100 | 0.70 |
由于胶体金颗粒在电解质中不稳定,制备后应立即用大分子(如蛋白质)进行标记。胶体金颗粒对蛋白质的吸附作用取决于pH值。在pH值=pI值时,蛋白质溶解度最小,水化程度最小,最容易吸附到疏水的金颗粒表面,但在实际操作中,一般胶体金溶液的pH值调到稍高于标记用蛋白质的PI值,这样蛋白质带正电,结合更稳定,可用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCL调节胶体金溶液的pH至选定值,但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时,胶体金会阻塞pH计的电极,因此可用普通PH试纸先调到目标pH值附近再换用精密pH试纸调节,也可以用胶体金专业pH计调节pH。标记应在磁力搅拌下,逐滴加入待标记蛋白溶液,混匀30min后继续在磁力搅拌下加入10%BSA,使其终浓度为0.5%,搅拌混匀15min,再加入5%PEG 20000至终浓度为0.1%,再持续搅拌混匀15min,最后4℃静置过夜。
由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的双蒸水透析去盐,并通过离心及微孔滤膜过滤以除去细小颗粒,然后通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的待标记蛋白的最低浓度,这一浓度再加10%即为最佳标记蛋白量。标记好的胶体金还应加入终浓度为0.05%~0.1%的PEG 6000或PEG 20000作为稳定剂。
多种蛋白质、葡聚糖、PEG20000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用,一为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择十分重要,不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。
标记好的胶体金中往往还含有未结合的蛋白质、未充分标记的胶体金以及标记过程终形成的各种聚合物。因此标记好的胶体金还需经过纯化才能使用,一般纯化方法有离心法和凝胶过滤法等。
采用离心法时,一般颗粒10nm以上的胶体金可高速离心,颗粒小于10nm的胶体金要用超速离心,在4℃离心15min至1h不等,弃上清,沉淀用原体积的0.02mol/L TBS pH8.2(含1%BSA,0.05%叠氮钠)溶解,重复离心2~3次,沉淀溶于原体积的1/10 PBS溶液中,4℃保存备用。
凝胶过滤法为纯化免疫胶体金的最好方法,过滤的胶体金颗粒比较均匀,不容易凝集,而离心法转速高,时间长,胶体金颗粒沉淀后容易凝集,用凝胶过滤法克服了这一弱点。将浓缩好的免疫胶体金先以1500r/min离心除去大的聚合物,取上清液过柱。可用Sephacryls-400或Sepharose-4B(或6B)装柱,0.02mol/L TBS pH8.2平衡和洗脱。
南京德泰生物工程有限公司 Nanjing Detai Bioengineering Co.,Ltd. ©2025 All Rights Reserved