胶体金的制备及标记

胶体金是由氯金酸（HAuCl₄）在还原剂作用下形成的纳米级金颗粒（直径1~150nm）分散体系，其颜色随粒径变化呈现橙黄色至紫红色。胶体金因具有高电子密度、稳定性及与生物大分子（如抗体、抗原）的静电结合能力，被广泛应用于免疫检测、生物标记及诊断试剂开发。

胶体金的制备

制备颗粒均匀、分散度好的胶体金非常关键，胶体金颗粒直径的变异范围太大会影响试验的稳定性和重复性。如胶体金颗粒的形状不规则或粒径不均一，胶体金标记物容易解离、沉淀，从而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象。胶体金的制备过程中的细节关乎制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度。操作环境应保持清洁无尘粒，最好有专用工作区。所用玻璃容器必须绝对清洁，玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，产生凝集颗粒，玻璃器皿用前要经过酸处理、超声洗涤处理，并用蒸馏水、超纯水依次冲洗浸泡，然后烘干备用。

胶体金的制备一般采用还原法，其原理是利用还原剂将氯金酸溶液中的金离子还原成金原子。常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等，根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备5~150nm不等的胶体金。一般还原剂用量越大制备的胶体金颗粒越小。如制备颗粒直径在5~12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸，制备大于12nm直径的胶体金则用柠檬酸钠。

柠檬酸钠还原法（经典方法）

制备方法：
（1）取100mL双蒸水配制0.01%氯金酸水溶液，使用水浴磁力搅拌锅加热至沸腾；
（2）不断搅拌下快速加入1%柠檬酸钠水溶液，继续搅拌加热约15min至溶液颜色稳定不变；
（3）待其冷却后使用双蒸水补至原体积。
粒径控制：
通过调整柠檬酸钠的用量可制备不同粒径的胶体金。下表列举了制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸钠的用量。

粒径（nm） 0.01%氯金酸（mL） 1%柠檬酸三钠（mL）

16 100 2.00

24.5 100 1.50

41 100 1.00

71.5 100 0.70
注意事项：
（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。
（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸水或三蒸水，或者是高质量的去离子水。
（4）每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。

粒径（nm）	0.01%氯金酸（mL）	1%柠檬酸三钠（mL）
16	100	2.00
24.5	100	1.50
41	100	1.00
71.5	100	0.70

胶体金的标记

由于胶体金颗粒在电解质中不稳定，制备后应立即用大分子（如蛋白质）进行标记。胶体金颗粒对蛋白质的吸附作用取决于pH值。在pH值=pI值时，蛋白质溶解度最小，水化程度最小，最容易吸附到疏水的金颗粒表面，但在实际操作中，一般胶体金溶液的pH值调到稍高于标记用蛋白质的PI值，这样蛋白质带正电，结合更稳定，可用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCL调节胶体金溶液的pH至选定值，但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时，胶体金会阻塞pH计的电极，因此可用普通PH试纸先调到目标pH值附近再换用精密pH试纸调节，也可以用胶体金专业pH计调节pH。标记应在磁力搅拌下，逐滴加入待标记蛋白溶液，混匀30min后继续在磁力搅拌下加入10%BSA，使其终浓度为0.5%，搅拌混匀15min，再加入5%PEG 20000至终浓度为0.1%，再持续搅拌混匀15min，最后4℃静置过夜。

由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的双蒸水透析去盐，并通过离心及微孔滤膜过滤以除去细小颗粒，然后通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的待标记蛋白的最低浓度，这一浓度再加10%即为最佳标记蛋白量。标记好的胶体金还应加入终浓度为0.05%~0.1%的PEG 6000或PEG 20000作为稳定剂。

多种蛋白质、葡聚糖、PEG20000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用，一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择十分重要，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

胶体金标记后的纯化

标记好的胶体金中往往还含有未结合的蛋白质、未充分标记的胶体金以及标记过程终形成的各种聚合物。因此标记好的胶体金还需经过纯化才能使用，一般纯化方法有离心法和凝胶过滤法等。

采用离心法时，一般颗粒10nm以上的胶体金可高速离心，颗粒小于10nm的胶体金要用超速离心，在4℃离心15min至1h不等，弃上清，沉淀用原体积的0.02mol/L TBS pH8.2（含1%BSA，0.05%叠氮钠）溶解，重复离心2~3次，沉淀溶于原体积的1/10 PBS溶液中，4℃保存备用。

凝胶过滤法为纯化免疫胶体金的最好方法，过滤的胶体金颗粒比较均匀，不容易凝集，而离心法转速高，时间长，胶体金颗粒沉淀后容易凝集，用凝胶过滤法克服了这一弱点。将浓缩好的免疫胶体金先以1500r/min离心除去大的聚合物，取上清液过柱。可用Sephacryls-400或Sepharose-4B（或6B）装柱，0.02mol/L TBS pH8.2平衡和洗脱。