杂交瘤技术是一种将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。自1975年塞萨尔·米尔斯坦(César Milstein)和乔治·科勒(Georges Köhler) 开发了杂交瘤融合技术，并把它应用到小鼠单克隆抗体的开发上后，对现代生物医学研究产生了重大的影响，这两位科学家也因此获得了1984年诺贝尔生理和医学奖。
在鼠单抗杂交瘤技术中，研究人员首先收集免疫后小鼠的B淋巴细胞，并将其与Balb/c小鼠的骨髓瘤细胞（Myeloma cell）进行融合，形成永生的杂交瘤细胞；然后通过有限稀释筛选，鉴定出能产生特异性抗体的单克隆细胞株，再对该细胞株进行放大培养来大规模生产单克隆抗体。
鼠杂交瘤技术此后迅速发展成熟，并被广泛应用于抗体的生产。然而相较于小鼠，兔拥有更大的脾脏，具有更低的免疫优势，拥有基因转换和体细胞超突变两种抗体多样化机制，可产生高特异性、高亲和力的抗体。因此科学家们一直在致力于寻找能够和兔B淋巴细胞融合的骨髓瘤细胞。然而由于通过兔B细胞病毒转化产生骨髓瘤细胞系的方法存在较大的困难，杂交瘤技术依旧局限于啮齿动物。
1988年，兔单克隆抗体制备方法首次被《Science》杂志报道 。该方法通过小鼠和兔的异源杂交（Mouse–rabbit heterohybridomas method）形成杂交瘤生产兔单克隆抗体，但这种小鼠-兔异源杂交瘤存在分泌抗体效率较低、无法长时间分泌且分泌出的抗体性质不稳定等弊端。
科学家们作出了诸多尝试努力，如何让瘤细胞能够比较有效地和产生抗体的B细胞进行融合，并使融合以后产生的细胞株能够长期稳定地分泌抗体是这项技术的主要难点。这样的尝试过程历经一代又一代的技术革新与经验积累，终于有一天成功了。
1995年，芝加哥洛约拉大学（Loyola University）的凯瑟琳·奈特（Katherine Knight）用过量表达两个致癌基因v-abl和c-myc的双转基因兔成功培育出可以作为融合细胞的兔骨髓瘤细胞株，即240E-1。它成为了首个用于生产兔单克隆抗体的兔源杂交瘤融合细胞。纵观兔单抗开发历程，这是一个重要的里程碑，但在当时却并没有引起广泛重视。究其原因还是稳定性的问题——兔杂交瘤细胞不如常规鼠杂交瘤细胞稳定，并且由于融合和转化的效率低下，限制了兔源杂交瘤细胞生产单抗的应用与推广。
图1 兔骨髓瘤细胞株240E-1
第一代兔源融合细胞株（240E-1)随着培养代数的增加，其表现极不稳定，分泌IgG的能力也随之下降。虽然这种不稳定性在鼠杂交瘤细胞中也有存在，但在兔杂交瘤细胞中此现象更为普遍和明显。当时许多实验室从奈特教授那里得到了该细胞株，但都无法产生有价值的、稳定的杂交瘤。
加州大学旧金山分校的朱伟民和罗布特·派特拉（Robert Pytela）并没有放弃继续探索。在长达一年多的时间里，他们通过对获得的240E-1细胞株反复亚克隆来改良融合细胞系的特征。对选定的亚克隆做进一步分析，筛选了成千上万个240E-1的延伸细胞株并测试它们的稳定性，以确保它们能产生稳定并高效分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。1997年，终于非常幸运地获得了唯一一株可生产较为稳定的兔源杂交瘤，并能持续分泌兔单克隆抗体的融合细胞株240E-W。
自240E-W细胞株被发现以来，朱伟民团队进一步完善优化融合细胞株，相继开发出240E-W2和240E-W3细胞系，进一步实现了高效率融合，所产生的兔杂交瘤细胞株无内源性IgG表达、有更高的基因稳定性和更稳定的IgG分泌能力。
图2 骨髓瘤细胞的演变进程
一般来说，使用240E-W融合细胞生产兔单克隆抗体的过程与杂交瘤制备鼠单抗的过程相似，主要包括以下步骤：(1)兔子免疫；(2)骨髓瘤细胞的制备；(3)B淋巴细胞和融合伴侣的融合；(4)HAT筛选并扩大稳定的杂交瘤细胞；(5)冷冻选择的杂交瘤细胞；(6)克隆处理。
图3 杂交瘤技术制备兔单抗流程图
相较于鼠单抗，兔杂交瘤技术制备出的单抗虽然具备更高的亲和力和特异性，但制备时间长、步骤繁琐、重复生产性能差依然是它的局限。不仅如此，该技术不能制备无免疫原性和高毒性的抗原的抗体，并且功能筛选只能在克隆筛选和培养以后。更重要的是，杂交瘤细胞多次传代不稳定易退化的特性依然存在，且生产出的单抗批次间差异较大。
兔杂交瘤技术的垄断导致兔单抗很少应用在制药领域，多数为研究使用的兔多抗。目前，全球已成功上市的兔单抗药物仅有诺华的Beovu和灵北的Vyepti。但是，随着单抗发现技术的不断发展，催生出了走出杂交瘤的单B细胞单抗制备的成熟技术。该技术可直接对兔抗原特异性记忆B细胞和浆细胞进行筛选，大大缩短了兔单抗的制备周期，产生的抗体多样性丰富，独特表位发现概率更高。相信不久会有更多的兔单抗创新药物被源源不断地推出应用于临床诊断及治疗。
参考文献
[1]Spieker-Polet H, Sethupathi P, Yam P C, et al. Rabbit monoclonal antibodies: generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(20):9348-9352.
[2]Knight K L, Crane M A. Generating the antibody repertoire in rabbit[J]. Adv Immunol,1994,56:179-218.
[3]Yam Pi-Chen,Knight Katherine L. Generation of rabbit monoclonal antibodies.[J]. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.),2014,1131.
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