大肠杆菌表达系统

本文主要介绍了大肠杆菌蛋白表达原理、具体操作步骤、大肠杆菌表达系统及其与其他系统的比较等。

大肠杆菌蛋白表达原理

诱导原理：Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后，其蛋白构象就发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，发生转录。详情见IPTG诱导蛋白表达的原理

大肠杆菌表达系统步骤

不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。基因构建参考密码子优化，蛋白纯化参考蛋白纯化专题。以下内容主要包括蛋白表达鉴定：
1.  表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择

• 拿到质粒，离心（3000r/min；2min）
• 在质粒中加入TE（使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加入TE的量），一般为（1μg质粒加20μLTE；2μg质粒加50μLTE；5μg质粒加100μL TE）
• 将质粒与TE混匀，加入2μL混液于感受态细胞中
• 将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min
• 取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,
• 再次放入冰箱（4℃）中，3min
• 拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中
• 放入摇床（37℃;  195r）中,  30nim至60min; （最佳45min）
• 取出离心（3000r/min；2min）
• 去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂平板，（先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min）
• 把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h至16h）

2.  表达鉴定第二天的任务,注意Pcold的表达温度

• 每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的L（4ml）试管中，编号为“0”“1”“2”“3”
• 将试管放入摇床（37℃；195r）中，（单抗3h左右；双抗4左右；刚开始用可见分光光度计测OD值；熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）），测OD值（0.6至0.8）
• 从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存
• 在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG（终浓度0.5mM最适）
• 视不同的载体选择适合的表达环境（PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h至4h（4支试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h至4h）。Pcold：全部15℃表达过夜）

3. 表达鉴定第三天，全菌的表达鉴定分析，注意控制溶质的量及溶液黏度

• 从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中，（若OD值不一样，值小的可多取）离心（6000r/min），5min, 去上清，留沉淀（沉淀少的，可再取菌液离心，尽量使沉淀量接近）
• 在每个离心管中加入500μL的DDH2O,悬浮沉淀，离心（6000r/min），5min, 去上清，留沉淀
• 在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀（当溶质适量且均一的情况下，加入量不变；当溶质多且粘稠时，应使加入量增大，为降低粘度也可减少上液量）
• 放入煮样器（100℃） 25min
• 取出后离心（6000r/min)  3min,  电泳检测。

大肠杆菌表达系统

• 质粒载体：小型环状DNA，能自我复制。一个完整的质粒载体必须要有复制起点、启动子、插入的目的基因、筛选标记以及终止子；此外对大肠杆菌表达载体的要求是：①操纵子以及相应的的调控序列，外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用；②SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7-13bp翻译效率最高；③多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。
• 目的基因：在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因；原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因含有内含子不能，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。此外还需提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。
• 表达宿主菌：表达蛋白的生物体即大肠杆菌。表达宿主菌的选择在大肠杆菌蛋白表达过程中是很重要的因素——多数人会直接选择实验室曾经用过的宿主菌，而不去追究原因。对于宿主菌的选择主要根据宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性，例如目的蛋白需要形成二硫键，可以选择Origami 2系列，Origami能显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达；目的蛋白含有较多稀有密码子可用Rosetta 2 系列，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因的表达水平。

大肠杆菌表达系统种类

• T7大肠杆菌表达系统

以T7启动子、T7RNA聚合酶等T7噬箘体转录体系的元件为核心构建的表达系统。T7 RNA聚合酶一种高活性的RNA聚合酶，mRNA的合成速度比大肠杆菌内的RNA聚合酶快5倍，并某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶转录的序列也可以转录，所以T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的存在的情况下，大肠杆菌本身的转录竞争不过T7噬箘体转录体系，最终受T7噬箘体启动子控制基因的转录。

• Lac和Tac大肠杆菌表达系统

它是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的大肠杆菌表达系统，具有多顺反子结构，结构排列为：

启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） – 结构基因（lacZ-lacY-lacA）

原理：在无诱导物的情况下，负调节因子lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。加入诱导剂后，IPTG与lacI基因产物结合，使操纵基因解离出来，lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。

• PL和PR大肠杆菌表达系统

以启动子PL、PR为核心构建的表达系统。PL和PR表达系统具有很强的启动转录能力，诱导时不需要加入化学诱导剂，成本低廉，但在热刺激过程中，大肠杆菌中的一些蛋白水解酶会被激活，降解所表达的外源蛋白；其次是在大规模发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式提高温度，需要较长的时间，这会降低诱导效果，从而对重组蛋白的表达量有影响。

此外还有其他表达系统，如pH调控型、营养调控型、糖原调控型等。

大肠杆菌表达系统比较

大肠杆菌与其他表达系统比较

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