流式细胞术

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（例如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术，具有高通量、高灵敏度和定量分析三大优势。流式细胞仪可快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。

流式细胞仪的结构

流式细胞仪主要由三大系统组成：液路系统、光学系统和电子系统。

流式细胞仪示意图

图1 流式细胞仪示意图

液路系统由进样管、鞘液、流动室、压力控制系统和废液回收系统组成。液路系统可以将样品排列成单列细胞/颗粒流，并使细胞/颗粒稳定高速的通过流式细胞仪的检测点。光学系统由激发光源、光信号收集、分离系统（二向色镜、滤光片）和光信号检测器组成。当细胞/颗粒通过检测点时，激光束照射到单个细胞/颗粒上，产生前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）和荧光。所有这些光被透镜收集，二向色镜和滤光片分离并导向相应的检测器，在检测器内转化为光电流。电子系统由信号放大器和模数转化器组成。电子系统对收集的信号进行放大，通过模数转化器转化为数字信号，以备保存和后续分析或下一步操作（分选）。

流式细胞仪工作原理

待测样品经荧光染料染色或标记后制成样品悬液，通过进样管进入流动室，由喷嘴喷出而成为细胞液流下并与入射激光束相交。细胞被激发而产生散射光和激发荧光。散射光信号包括前向散射信号和侧向散射信号。散射光信号和荧光信号被光电二极管和光电倍增管接收后可转换成电脉冲信号。无论是散射光或荧光信号，检测的目的都是要分析不同的粒子，分析的方法有两种，一是测量粒子通过激光束的最大电压，二是测量脉冲的面积，最后再经过A/D转换器将脉冲信号变换成二进制数字信号由计算机处理。散射光信号基本上反映了细胞体积的大小，荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度。粒子被逐一分析后即在屏幕上显示各种图形：直方图、二维散点图、等高图、灰度图和三维立体图等。

前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）

图2 前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）

流式细胞分选原理

由超声振荡器产生高频振荡，使流动室发生振动，把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴，有的液滴含有细胞。这些细胞在形成液滴前，光学系统已经测定了它们的信号（代表细胞的性质），如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合，仪器给充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后，其中被选定细胞的液滴就带有电荷，而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生向阴极或者向阳极偏转，从而达到分类收集细胞的目的。

流式数据展示：散点图与直方图

一般在硏究细胞样品时，首先关注的就是样品中细胞的FSC-SSC散点图，x轴代表FSC值，y轴代表SSC值，将细胞都显示于该散点图中。FSC的值代表细胞的大小。细胞体积越大，其FSC值就越大。SSC的值代表细胞的颗粒度（granularity）。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。

图3样品中的细胞包含淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等。在该图中，FSC越往右，其信号越强，说明细胞越大，单核细胞和粒细胞的体积大于淋巴细胞。SSC越往上，说明细胞颗粒度越强，单核细胞和粒细胞颗粒度比淋巴细胞强，因此可以根据细胞的大小和颗粒度实现了对细胞进行分群和分类。

流式细胞散射光散点图

图3 流式细胞散射光散点图

流式细胞散点图在表示荧光信号的时候也有非常重要的作用。调节性T细胞的有两个标志CD4和CD5。如图4左图所示，X轴表示CD4信号，Y轴表示CD25信号。由CD4、CD5的丰度可以将这些细胞分为CD4-CD25+（左上），CD4-CD25-（左下），CD4+CD25（右上），CD4+CD25-（右下）四个部分。

流式细胞荧光散点图和直方图