多聚组氨酸标签(His-tag)介绍及亲和层析原理

本文描述了多聚组氨酸标签（His-Tag）融合蛋白使用Ni-IDA/Ni-NTA进行亲和层析的基本原理，优势，以及实验操作流程。

固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)，简称金属螯合亲合层析，是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签（His-Tag）在原核蛋白表达中的应用最为显著。

His-Tag可结合在目的蛋白的C末端或N末端，形成特殊的结构，以便于进行下一步的纯化及检测。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，所以可选择范围广，高盐，存在变性剂以及去垢剂的上样条件下进行纯化，His-Tag正逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

His-tag作为蛋白纯化时的首选标签，其优势在于：

N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；
采用IMAC（固定化金属离子亲合层析）纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便；
His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；
His-Tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；
与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；

His-Tag融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。

His-Tag亲和层析填料

His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。

Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同，Ni2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-IDA螯合了三价，Ni-NTA螯合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高，在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。

Ni-IDA和Ni-NTA结构图

IMAC在通常的情况下是比较稳定的，但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此，E.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂（通常存在于细菌的细胞周质中），导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化His-Tag融合蛋白的实验时，首先需要去除螯合剂。

Ni-NTA亲和层析实验

Ni-NTA分离带His标签的重组蛋白

Ni-NTA装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；
用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；
将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45um滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；
用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；
用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于低温环境中保存。

缓冲液组成：

缓冲液1

50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH₂PO₄ 19ml，0.5M Na₂HPO₄ 81ml，NaCl 29.3g，
加适量水溶解后定容到1000ml。

缓冲液2

50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量，水调pH后定容到1000ml。

缓冲液3

不同咪唑浓度的缓冲液B配制：

咪唑浓度	缓冲液1量(ml)	缓冲液2量(ml)
10mM	98	2
50mM	90	10
100mM	80	20
200mM	60	40
300mM	40	60
400mM	20	80

咪唑洗脱原理

Ni柱中的氯化镍可以与有His-Tag的融合蛋白结合，也可以与咪唑进行结合，当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的
镍离子介质发生结合时，不同浓度的咪唑通过层析柱，就会将与镍配位的标签蛋白，杂蛋白等分别洗脱下来，从而得到高纯度目标蛋白。

附录：Ni-IDA和Ni-NTA的一些参数对比

名称	Ni-IDA	Ni-NTA
参数	指标
基质	6%交联琼脂糖凝胶
配基	亚胺二乙酸(IDA)	次氮基三乙酸（NTA）
粒径	45~165 µm	60~169 µm
金属离子密度	40 µmol/ml	20-40 µmol/ml
载量	25-30mg蛋白/ml	15mg蛋白/ml
柱体积	1ml或5ml	1ml或5ml
柱尺寸（内径x高度）	0.9×1.57cm(1ml柱子) 0.9×1.57cm(5ml柱子)	0.6cmx2.8cm(1ml柱子) 1.4cmx2.98cm(5ml柱子)
推荐流速	1ml/min(1ml柱子) 5ml/min(5ml柱子)
最高流速	4ml/min(1ml柱子) 10ml/min(1ml柱子)	20ml/min(5ml柱子) 40ml/min(5ml柱子)
最高耐压	0.3MPa(3bar)	0.5MPa（5bar）
避免使用的试剂	螯合剂：EDTA、EGTA、柠檬酸等	>20mM硫化试剂 >10mM DTT 螯合剂：EDTA、EGTA 阴离子去污剂
pH稳定性	PH 2-14（短期，2h）；PH 3-12（长期，7天）