PCR引物设计

PCR技术实际上就是在模板DNA、引物、dNTP都存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面：一是引物与模板的特异结合；二是多聚酶对引物的有效延伸。因此，引物的设计对于PCR极为重要，引物设计的不好，会导致无法顺利扩增得到目的片段。

本文主要对PCR引物设计的原则，常见的引物设计工具及引物设计的总体流程做一介绍。

引物设计基本原则

设计PCR引物的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。根据多年来的实践经验，引物的设计有一些大家都认可的原则。

引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。具体实现这3条基本原则需要考虑诸多因素，如引物长度，GC含量，引物碱基分部，Tm值，引物特异性，形成引物二聚体及发夹结构的能值等等。

长度：引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38bp；
GC含量：引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
碱基分布:碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。3’端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3’端最后一个碱基最好不要是A或T，会导致错配；
Tm值：引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳；
引物序列在模板内没有相似性较高的序列，否则容易导致错配（设计完成后可以使用BLAST检索，确认引物特异性）；
引物二聚体及发夹结构的能值不能过高（能值的绝对值一般不要超过4.5），过高易导致产生引物二聚体带并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行；
引物修饰：引物的延伸是从3端开始的,不能进行任何修饰;引物的5端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性；
如果扩增区域为编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率；

常用的引物设计软件

目前引物的设计主要借助一些分子生物学软件或在线工具来实现。常见的引物设计软件有Oligo 6、Premier Premier、Primer 3、Vector NTI Suit、Dnasis、Omiga、Dnastar等。最为常用的是Oligo 6、Premier Premier及Primer 3。

Oligo 6

Oligo是一款非常著名的软件，可以实现引物的设计及引物的评估分析，是目前最好、最专业的引物设计软件。其主要功能包括：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

Premier Premier

PremierPremier是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件，也是一款应用很广泛的软件。利用该软件还可以实现简并引物的设计。

Primer 3

Primer 3是由美国whitehead生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费的在线PCR引物设计程序（在线网址：http://primer3.ut.ee/），一个非常简单却高效的引物设计在线软件。只需在目标序列中粘贴DNA序列后点击搜索即可。其中，可通过多种方式来对结果进行筛选，包括PCR产物的大小、引物大小、Tm范围和其它参数。同样，还可使用Primer3来设计用于PCR-ELISA的杂交探针和其他基于探针的PCR引物设计。

引物设计流程

引物设计及初步筛选

运用软件Premier Premier或Primer 3来设计引物，再用软件Oligo6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。

引物的二次筛选

引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出合适我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。本步骤应注意一下两点，一是得到一系列引物分别在Genebank中进行回检。也就是把每条引物在对比工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）的blastnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续10bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6bp的同源。二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪切位点，然后弃掉正好位于剪切位点的引物。

引物的修饰

引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等。

引物的最终评估

经过初次筛选和二次筛选后得到的那对引物便可以用于合成，合成后我们经过PCR扩增可以对引物进行最终的评估。一是PCR扩增的特异性和效率。经过PCR条件优化后能否获得特异性条带，即无目的条带之外的多余条带。另外，PCR产物的量是否足够，即无不出带和条带很弱的现象。二是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。如果差距太大（大于100bp），有可能是错配产物，三是是否形成引物二聚体带。
我们结合引物最终评估和测序的结果可以对引物设计的成败做出判定，为我们以后进行引物设计积累宝贵的经验。