实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR)，它是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对初始模板进行定量分析的方法。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它的出现解决了传统PCR不能对初始模板定量分析的问题。荧光定量PCR具有准确性高、灵敏度高、特异性强等优点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

荧光定量PCR原理

在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化检测产物量的变化，最终得到得到一条荧光扩增曲线图，扩增曲线横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

荧光定量PCR扩增曲线

图1：qPCR扩增曲线

一般而言，荧光扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的PCR产物量也不能计算出起始DNA拷贝数；只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。

荧光定量PCR常用术语

在了解荧光定量PCR如何对初始模板进行定量之前，需要了解几个在荧光定量PCR分析中常用的术语：

基线：实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中（一般为3-15个循环）的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或噪声。每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。基线的设置，会影响到荧光阈值及Ct值。
荧光阈值：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值默认是PCR 3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。
Ct值：Ct值指的是PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数。
标准曲线：标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。对已知拷贝数的标准样品做系列稀释，对不同稀释度的标准样品进行荧光定量PCR并记录Ct值，根据Ct值及拷贝数的对数绘制得到标准曲线，标准曲线的纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代Ct值。

如何实现对初始模板的定量

利用实时荧光定量PCR对样品的初始模板量进行定量分析，需要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再通过荧光定量PCR获得未知样品的Ct值，最后从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

利用标准曲线对初始模板进行定量分析

图2：对初始模板进行定量分析

标准曲线绘制

标准品的制备

设计特定引物，利用PCR对目的基因片段进行扩增，随后将目的基因片段克隆至载体中，测序验证是否为阳性重组质粒，最后收集阳性克隆质粒作为标准品。

绘制标准曲线

测定质粒的浓度，依据公式计算出质粒的拷贝数。对质粒进行系列稀释，分别作为模板进行荧光定量PCR并记录Ct值。最后依据起始拷贝数的对数及Ct值绘制标准曲线，得到标准方程。当需要对起始模板进行定量时，只需要得到扩增曲线，读得Ct值，带入标准方程即可对起始模板定量。

荧光标记方法

实时荧光定量PCR荧光标记方法可分为荧光染料法和荧光探针法两类。染料法是利用荧光染料可以嵌合到DNA双链内部的特性，来指示扩增产物的增加。而探针法是利用与靶序列特异结合的荧光探针的信号积累来指示扩增产物的增加。

荧光染料

染料法是利用荧光染料可以嵌合到DNA双链内部的特性，来指示扩增产物的增加。现以最常用的SYBR GreenⅠ为例，介绍染料法荧光定量PCR的工作原理：

荧光染料工作原理

图3：荧光染料法原理

SYBR GreenⅠ是一种荧光染料，可嵌合到双链DNA的内部。在游离状态下，SYBR Green Ⅰ发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈正比，随扩增产物的增加而增加，可通过荧光信号的积累来指示扩增产物的增加。

荧光探针

探针为一段寡核苷酸，可与DNA序列特异性结合，一个模板结合一个探针。探针5’端具有报告基团（R），可发光；3’端有荧光淬灭基团（Q），能吸收光。探针完整时R基团所发射的荧光能量被Q基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号。随着扩增的进行，探针会被聚合酶水解，报告基团发出的光没有被淬灭基团吸收，从而被仪器检测到。每扩增一条DNA链，释放一个荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

荧光探针工作原理

图4：探针原理

目前已经开发出来的探针有Taq Man探针、Taq man MGB探针、双杂交探针、分子信标、Lux杂交探针、Simple proble探针等。

探针法与染料法对比

	探针法	染料法
优点	特异性高重复性好	对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA 使用方便，不必设计复杂探针成本低
缺点	只适合一个特定的目标探针价格较高	容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性对引物特异性要求高