磷酸化蛋白Western Blot检测

蛋白质磷酸化（phosphorylation）对于调控细胞功能而言是相当重要的，细胞生长、细胞增生、细胞中的讯号传递等现象都与蛋白质磷酸化息息相关，因此蛋白质磷酸化也是细胞生物学领域研究非常重要的一环。

Western blot是研究中最常使用来评估蛋白质磷酸化状态的实验技术，但想要把蛋白质磷酸化的Western Blot实验做好却往往是研究人员最大的梦魇。

ADC各组成部分及其在ADC设计、工程和功能中的作用

因此，在这里和大家分享此类型实验时应该要注意的几个事项与诀窍：

确定样品中是否表达目标蛋白质

在实验前需先查阅文献或通过预实验检测该样本是否表达目的蛋白，可以通过Uniprot、PhosphoSitePlus等数据库查询蛋白的磷酸化情况。正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，刺激条件各不相同，刺激的时间和强度也需要查阅文献和进行预实验来确定。若表达量偏低或根本检测不到则建议可以将样品以蛋白质组学的方式进行检测。若该样本根本就不表达目的蛋白，那就需要重新设计实验方案。在实验进行时，需要设置适当的阳性和阴性对照，可进一步确定抗体检测到的信号的特异性。

蛋白提取过程中的注意事项

蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，所以样品要新鲜，提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，避免反复冻融；样品处理最好在冰上操作，操作时间尽量短；用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4℃预冷；如果样品来源是组织，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态。

提取样品的过程要迅速，组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则即使条带出来也会很浅，结果可信度不高。除了内源性的蛋白磷酸酶外，也存在外源性的磷酸脢，通常是实验过程中的污染所造成的，因此在样品制备的过程当中请务必使用不含磷酸脢的试剂，而值得特别注意的是样品中或是实验环境中的细菌也会分泌磷酸脢，要特别留意。另外，还要注意检测蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸还要加1µmol/L的原钒酸钠，上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。提取的磷酸化蛋白需要妥善保存，收集完成后尽快蛋白变性并于-80℃分装保存，以保证降解程度最小。同时避免反复冻融导致磷酸基团的降解。

磷酸化蛋白检测中内参照的问题

磷酸化蛋白检测需要设置两个内参照，一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，另一个是普通蛋白检测的内参比如actin和GAPDH等。普通内参作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响，对于结果分析比对十分重要。
同时，总蛋白检测也是必需的，只检测磷酸化蛋白质的表达量并无法真实的说明细胞中磷酸化状况，只有将磷酸化蛋白质与总蛋白质相比，比值的升高或是降低才是有意义的。

抗体的选择

通常好的抗体可以决定70% Western Blot的成败，所以挑选好的磷酸化抗体绝对是一个非常重要的关键。德泰生物提供磷酸化鼠/兔单克隆抗体制备服务，在设计免疫原、合成磷酸化多肽及磷酸化抗体筛选、制备技术上具有丰富的经验，最终交付的抗体将通过磷酸化多肽与非磷酸化多肽的交叉验证。

抗体孵育与洗脱的注意事项

磷酸化蛋白转膜后，使用5%BSA（TBST溶解）进行封闭。避免膜封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。用洗涤时摇床的转速不能太快，洗涤的时间不能太长，洗涤过程每张膜分开洗涤。由于磷酸化蛋白表达量低，占总蛋白量的极少部分，因此抗体孵育时可加大一抗浓度后4℃过夜，保证抗体有充分的结合时间。一抗孵育完毕后回收抗体重复使用，二抗孵育室温1h。

抗体洗脱液用来去除已结合的抗体，但也会去除部分蛋白，导致蛋白信号变弱。实验过程水浴温度须准确控制，水温过高会导致较多目的蛋白被去除。抗体洗脱时膜一定要完全泡在抗体洗脱液中，将塑料膜完全浸入水中使其受热均匀，否则导致显影出来的总蛋白不均一，影响结果分析。