酵母双杂交

酵母双杂交系统（Yeast Two-Hybrid Technique）是由Fields和Song提出的，在酵母中研究蛋白间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法，以其简便、灵敏、高效以及能反映蛋白间在活细胞内的相互作用等特点得到广泛应用。德泰生物拥有核蛋白及膜蛋白酵母双杂交双重体系，提供从酵母文库构建，酵母文库筛选，点对点酵母双杂交验证一站式服务，经验丰富，专业技术人员一对一提供为您解答疑问。

服务优势

高灵敏度，可以检测瞬时/弱相互作用；
生理环境模拟，真核表达系统中检测活细胞内的相互作用；
拥有核/膜酵母双杂交系统，覆盖不同蛋白类型；
丰富建库经验，支持高通量文库筛选。

服务原理

核酵母双杂交系统

核酵母双杂交系统适用于可溶性蛋白、核内蛋白互作研究，是根据真核转录调控的特点设计的。真核生物转录因子含有两个相对独立的功能区域：DNA结合结构域（DNA binding domain, DBD）和转录激活结构域（activation domain, AD）。当DBD与AD二者在空间上充分接近时，则呈现完整转录因子的转录激活活性。将DBD与已知的蛋白X，又称为诱饵蛋白（bait）融合，AD与待研究靶蛋白Y（prey）或cDNA文库融合，当蛋白X和Y相互作用时，DBD与AD在空间上接近，激活下游报告基因（如HIS3/ADE2/LacZ），可通过营养缺陷筛选或显色反应判断互作。

核酵母双杂交系统基本原理

Fig1. 核酵母双杂交系统基本原理

膜酵母双杂交系统

膜酵母双杂交系统适用于膜蛋白、可溶性蛋白互作研究，通常使用分裂-泛素系统（split-ubiquitin system）。泛素是一段能与蛋白结合并介导蛋白降解的短肽。多个泛素分子共价结合到靶蛋白上形成多聚泛素链，泛素特异性蛋白酶以一种26S蛋白酶复合体的形式识别并降解靶蛋白，同时将泛素释放至胞质，进入下一轮循环。分裂-泛素系统正是建立在这一特性之上的。在该系统中，已知蛋白X与泛素C端的一段多肽（Cub）融合表达，待研究靶蛋白Y与泛素N端一段经过修饰的多肽（NubG）融合表达。修饰使得泛素N端的多肽不能正确折叠，从而使其无法与泛素C端的多肽结合形成完整的泛素。如果蛋白X与蛋白Y存在相互作用，带动Cub和Nub在空间上接近，形成完整泛素分子，使得UBPs可以识别并将泛素与融合表达的转录因子分离。转录因子进入核内，进一步启动报告基因的表达。

膜酵母双杂交系统基本原理

Fig2. 膜酵母双杂交系统基本原理

服务内容

酵母文库构建与筛选服务（Gateway法）

服务阶段	服务内容	周期	客户提供	交付
样品RNA提取（可选）	样品准备 RNA提取 mRNA分离	2周	动植物组织/细胞/总RNA* 基因序列/蛋白序列/质粒	初级文库质粒 200ug 初级文库菌液3管次级文库质粒 200ug 次级文库菌液3管诱饵质粒项目报告
cDNA文库构建	cDNA合成初级文库构建次级文库构建	5周
载体构建	诱饵基因A基因合成（可选）亚克隆	2~3周
酵母菌株转化	酵母菌株转化自激活检测毒性检测	2~3周
自激活抑制（可选）	自激活抑制	1周
文库筛选	初筛复筛阳性克隆鉴定	2周
阳性克隆测序	筛选结果测序数据分析	1周
回转验证	回转验证	1周

*样品送样要求：细胞（≥10⁸ cells）；植物叶片组织（≥4 g）；植物根茎或种子（≥8 g）；动物组织（≥1 g）；总RNA（≥200 μg），所有需要抽提RNA或RNA样本需干冰运输。

酵母双杂交验证服务（核体系/膜体系）

服务阶段	服务内容	周期	客户提供	交付
载体构建	诱饵基因A/猎物基因B基因合成（可选）分别亚克隆至相应载体	2~3周	基因序列/蛋白序列/质粒	表达质粒测序报告互作检测报告原始图片
酵母菌株转化	酵母菌株转化自激活检测毒性检测	2~3周
相互作用验证	互作验证（包含阴性对照/阳性对照）	2~3周